综述：从概念到临床：液体活检中DNA甲基化生物标志物的发展路线图

《Oncogene》：From concept to clinic: a roadmap for DNA methylation biomarkers in liquid biopsies

本综述系统阐述了DNA甲基化（DNA methylation）生物标志物在液体活检（liquid biopsy）中从开发到临床应用的完整路径。文章聚焦于液体活检来源（如血液、尿液）的选择、生物标志物的发现流程（包括全基因组甲基化分析技术如WGBS、RRBS、阵列）以及靶向验证策略，强调了标准化、优化和质量控制对于提高检测准确性、可重复性和临床效用（clinical utility）的重要性，旨在弥合转化医学的鸿沟。

　　

液体活检来源的选择

癌症是全球性的重大健康挑战，国际癌症研究机构（IARC）预测到205年将出现超过3500万新发癌症病例。面对这一严峻形势，液体活检作为一种微创技术，为癌症的筛查、诊断、预后评估、微小残留病灶（MRD）检测、复发早期识别和治疗反应预测提供了极具前景的解决方案。肿瘤释放的循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）和外泌体等物质进入血液、尿液、唾液、胆汁和精液等各种体液，为生物标志物发现提供了比组织活检更全面的肿瘤信息。

血液是最常用的液体活检来源，其循环系统遍布全身，能够收集来自不同解剖位置肿瘤脱落的物质。血浆因其ctDNA富集度更高且基因组DNA污染较少而优于血清。然而，血液中肿瘤信号被高度稀释，ctDNA含量低且不稳定，检测极具挑战性。相比之下，局部体液（如尿液对于膀胱癌、胆汁对于胆管癌、脑脊液对于脑瘤）通常能提供更高的肿瘤源性信号浓度和更低的背景噪音，从而可能显著提高生物标志物检测的准确性和临床效用。例如，在膀胱癌中，尿液检测TERT突变灵敏度高达87%，远高于血浆的7%。

DNA甲基化生物标志物的发现

DNA甲基化是指在胞嘧啶的5‘碳位上添加甲基，通常发生在CpG二核苷酸上，形成5-甲基胞嘧啶。这种表观遗传修饰在不改变DNA序列的情况下调控基因表达和染色质结构。在癌症中，DNA甲基化模式发生显著改变，通常表现为全基因组的低甲基化和CpG富集基因启动子的高甲基化。启动子高甲基化常导致关键肿瘤抑制基因沉默，而全局低甲基化可能诱导染色体不稳定性，共同驱动恶性转化。这些改变在肿瘤发生早期出现且在整个肿瘤进化过程中保持稳定，使其成为理想的生物标志物。此外，DNA双螺旋结构的固有稳定性以及甲基化对cfDNA碎片化的影响（核小体相互作用有助于保护甲基化DNA免受核酸酶降解），使得甲基化标志物在样本采集、储存和处理过程中更具抵抗力。

成功的生物标志物发现策略依赖于优化的研究设计、严格的预分析程序以及先进的分子和生物信息学技术。遵循诊断准确性研究报告标准（STARD）指南有助于提高研究的完整性和透明度。发现阶段的样本选择至关重要：虽然组织样本传统上被广泛使用，但直接将液体活检样本（如cfDNA）纳入发现阶段可能更具优势，能够识别在体液中固有可检测的标志物，减少从发现到应用的步骤。例如，Hlady等人证明，直接从cfDNA中识别出的候选标志物性能优于从组织样本中初步识别的标志物。

预分析步骤（包括采血管类型、处理时间、储存温度、离心方案和DNA纯化方法）对下游分析的DNA质量和数量有显著影响。在DNA甲基化分析前，通常需要进行预处理。亚硫酸氢盐转化是金标准，但会导致DNA严重降解。酶学转化（如EM-seq）作为一种更温和的替代方案出现，能产生更长的DNA片段，但cfDNA回收率较低。

甲基组学生物标志物发现得益于高通量技术的进步。微阵列（如Illumina 450K/EPIC）价格适中，生物信息学流程成熟，广泛应用于识别肿瘤和对照之间的差异甲基化CpG位点。全基因组甲基化测序（WGBS）和简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）提供更广的基因组覆盖度，有利于设计更精确的标志物检测方法。富集技术（如甲基化DNA免疫共沉淀测序，MeDIP-seq）也是一种经济有效的全基因组甲基化分析方

法。第三代测序技术（如纳米孔测序）能够实时检测DNA甲基化而无需亚硫酸氢盐转化，前景广阔。优化的生物信息学工作流程，例如识别差异甲基化区域（DMRs）而不仅仅是单个CpG位点，可以增加后续靶向验证分析的稳健性。

对照组的选择直接影响生物标志物测试的特性。除了癌旁组织或健康人样本，还应包括临床症状相似的非癌患者（如肝硬化患者对于肝细胞癌）、患有癌前病变（如巴雷特食管对于食管腺癌）或其他类型癌症的患者，以确保测试能准确区分癌症与其他状况。年龄匹配也很重要，因为DNA甲基化通常随年龄增长而增加。“零背景”生物标志物（即在对照样本中无甲基化信号）的策略对于早期癌症检测尤其有利，可以最大限度地减少验证过程中的干扰。

靶向生物标志物分析

将候选生物标志物从大规模发现转化为适合临床常规应用的检测方法，需要灵敏、稳健、快速且成本效益高的靶向方法和检测手段。

在现有的FDA批准或商业可用的DNA甲基化液体活检检测中，大多数依赖于定量甲基化特异性PCR（qMSP）。PCR方法因其可靠性和精确性被视为靶向分析的金标准，且平台普及。数字PCR（dPCR）通过将样本分成数千个分区，显著降低了背景DNA的竞争，对稀有事件的检测灵敏度更高（检测限LOD可达~0.001%），并支持多重检测。下一代测序（NGS）可以检测更大的生物标志物面板，可能提高测试准确性，例如Shield测试（Guardant Health）使用NGS检测包含DNA甲基化、突变和碎片化模式的多标志物面板。

无论采用何种靶向方法，确保每个步骤的高质量和标准化都将提高生物标志物测试获得临床效用的可能性。这包括精确选择靶向CpG位点（因为不同位点可能导致甲基化频率差异）、选择合适的内部参照进行标准化（例如针对多基因座的ALU序列或4Plex对照）、以及严格的质量控制。遵循MIQE（定量实时PCR实验发表的最低信息）指南等标准有助于提高实验管道质量。

在靶向分析阶段，继续纳入相关的对照组至关重要，特别是对于液体活检，目标生物标志物常与其他组织的DNA片段共存。血液生物标志物在与健康对照比较时可能表现良好，但可能难以区分癌症与非癌性疾病。

证明分析有效性、临床有效性和临床效用

美国国家医学院建议，肿瘤生物标志物在证明其分析有效性和临床效用之前，不应在临床实践中常规使用。

分析有效性是指检测方法能够准确、可重复、可靠地检测和测量目标生物标志物的能力。关键评估指标包括灵敏度、特异性、准确性和稳健性，应使用代表真实临床环境的样本进行评估。所需的分析性能取决于预期的临床应用（如普通人群筛查、高风险监测、治疗反应预测或复发检测）。

临床有效性是指检测方法能够根据结果（如是否存在癌症、治疗反应）将人群显著分为两个或更多组的能力。这涉及确定阈值或临界值，并评估灵敏度、特异性、阴性预测值（NPV）、阳性预测值（PPV）等参数。临床验证最好使用独立于发现系列的盲法患者样本系列进行，且患者特征应反映目标人群。

临床效用要求生物标志物具有高的分析和临床有效性，并能证明在指导临床策略时改善了患者结局。证明临床效用最可靠的方法是通过设计良好、有足够把握度的前瞻性临床试验（观察性或干预性）。对于罕见癌症，可采用小型或适应性试验。此外，也可使用既往前瞻性试验中收集的存档标本进行前瞻性-回顾性研究。

总结

成功将DNA甲基化生物标志物从实验室推向临床涉及多个方面。液体活检来源的类型显著影响检测准确性，局部体液对某些癌症类型可能优于血液。在发现阶段直接使用液体活检样本可能提高最终标志物的准确性。测序和微阵列方法各有优劣，选择取决于资源、成本和下游验证方法。适当临床病例和对照组的选择对于发现和验证阶段都至关重要。最终，在独立样本系列中进行临床验证，并通过临床研究证明临床效用是必不可少的。这一从方法选择、样本制备到严格验证和临床效用证明的综合方法，是成功实现生物标志物转化的关键。