去泛素化酶通过切割泛素融合核糖体蛋白并拮抗其UFD降解通路来调控核糖体功能

《Molecular Cell》：Deubiquitinases cleave ubiquitin-fused ribosomal proteins and physically counteract their targeting to the UFD pathway

本研究针对真核生物中泛素-核糖体蛋白融合前体（Ub-RPs）的加工机制这一关键科学问题，研究人员开展了关于去泛素化酶（DUBs）调控Ub-RPs稳定性与功能的研究。通过构建多种Ub-RP突变体，结合活性探针和质谱分析，发现未加工的Ub-RPs通过K29/K48异型泛素链被UFD通路降解，而DUBs不仅催化切割Ub-RPs，还能通过非催化方式结合Ub-RPs并拮抗UFD通路。该研究揭示了DUBs在维持蛋白质稳态中的双重功能，为理解核糖体生物发生与泛素系统之间的交叉调控提供了新机制。

　　

在真核细胞错综复杂的分子网络中，蛋白质的合成与降解如同精密的天平两端，维持着生命的动态平衡。核糖体作为蛋白质合成的工厂，其自身的组装与功能调控更是细胞活动的核心。有趣的是，在人类基因组中，编码泛素（Ubiquitin, Ub）——这个主要负责标记蛋白质以供降解的小分子——的基因，有两个竟然会编码出"泛素-核糖体蛋白融合前体"（Ubiquitin-ribosomal protein fusions, Ub-RPs）。具体来说，UBA52基因编码泛素与大亚基核糖体蛋白RPL40（eL40）的融合体，而UBA80基因编码泛素与小亚基核糖体蛋白RPS27a（eS31）的融合体。这种奇特的基因结构在酵母到人类等真核生物中高度保守，暗示着其背后可能隐藏着连接蛋白质合成与降解两大过程的重要生物学逻辑。

在酵母中的研究表明，这些Ub-RP融合蛋白需要被一类叫做去泛素化酶（Deubiquitinases, DUBs）的蛋白酶及时切割，才能释放出有功能的核糖体蛋白（RPs）用于核糖体组装，同时贡献到细胞的游离泛素池中。如果Ub-RP不能被正确切割，带着泛素"帽子"的核糖体蛋白就无法正常装配到核糖体上，会导致核糖体功能缺陷。然而，在人类细胞中，究竟是哪些DUBs负责处理Ub-RPs？这些切割事件是如何被调控的？未能被及时切割的Ub-RPs的命运又是怎样的？这些问题长期以来悬而未决。解答这些问题，对于深入理解细胞如何精细协调核糖体功能与蛋白质降解，从而维持蛋白质稳态（Protein homeostasis）至关重要。

为了揭开这些谜团，由Stephanie Patchett和Seyed Arad Moghadasi作为共同第一作者，Tony T. Huang作为通讯作者的研究团队在《Molecular Cell》上发表了一项研究。他们设计了一套精巧的实验策略，系统地探究了人类细胞中Ub-RPs的加工、调控及其功能影响。

研究人员首先构建了能够表达C末端带有HA标签的野生型Ub-RPL40和Ub-RPS27a、缺失泛素的突变体（ΔUb）以及两种切割抗性突变体（一种是破坏DUB切割位点的双甘氨酸突变为丙氨酸，GG/AA；另一种是破坏DUB结合的亮氨酸73突变为脯氨酸，L73P）的质粒。将这些质粒转入人胚肾细胞（HEK293T）后，他们发现野生型Ub-RPs能够被有效切割，产生成熟的核糖体蛋白。而两种切割抗性突变体，尤其是L73P突变体，其蛋白水平显著降低，暗示其可能被快速降解。

为了探究切割抗性Ub-RPs对核糖体功能的影响，研究人员通过蔗糖梯度沉降分析了这些蛋白在核糖体组分中的分布。结果显示，虽然未切割的Ub-RPs能够被整合到核糖体亚基（40S或60S）和80S核糖体中，但它们几乎无法进入活跃翻译的多聚体（Polysomes）中。这表明，Ub-RPs的切割是核糖体行使正常翻译功能所必需的，这与之前在酵母中的发现一致。

那么，那些未能被切割的Ub-RPs，尤其是稳定性很差的L73P突变体，在细胞中是如何被清除的呢？研究人员推测它们可能被泛素-蛋白酶体系统降解。实验证实，蛋白酶体抑制剂MG132能够显著稳定L73P突变体，而对GG/AA突变体影响不大。进一步的机制探索揭示，L73P Ub-RPs的降解依赖于其N端泛素模块上的特定赖氨酸残基（K29和K48）的泛素化。通过泛素链限制性（UBICREST）分析，他们发现连接在L73P Ub-RPs上的泛素链主要是K29和K48连接的异型链。这种特异的泛素链修饰模式，将研究指向了一个保守的蛋白质降解通路——泛素融合降解（Ubiquitin-fusion degradation, UFD）通路。此前，UFD通路被认为主要降解带有非切割型泛素融合的异常蛋白，而本研究提示，内源性的Ub-RP融合蛋白可能是UFD通路的重要生理底物。

为了寻找负责Ub-RPs泛素化的E3泛素连接酶，研究人员通过免疫共沉淀结合质谱分析，筛选与稳定型Ub(K0,L73P)-RP突变体相互作用的蛋白。他们发现E3连接酶TRIP12和HUWE1显著富集，这两种酶已知在UFD通路中协作形成K29/K48泛素链。基因敲低或敲除实验证实，抑制TRIP12或HUWE1能够稳定L73P Ub-RPs。体外泛素化实验也直接证明了TRIP12可以催化Ub-RPL40的泛素化。这些结果确定了TRIP12和HUWE1是介导未加工Ub-RPs通过UFD通路降解的关键E3连接酶。

另一方面，研究人员也致力于鉴定负责切割Ub-RPs的DUBs。他们巧妙地设计并合成了基于Ub-RP的活性探针（Activity-based probes, ABPs），这些探针的泛素C末端Gly76被替换为脱氢丙氨酸（Dha），能够共价捕获并标记那些活跃作用于Ub-RPs的DUBs。利用这些探针从细胞裂解液中"钓"出DUBs并进行质谱鉴定，他们发现了一系列潜在的Ub-RP加工酶，包括之前被报道过的USP7、USP9X，以及新发现的CEZANNE/OTUD7B等。体外切割实验验证了其中多个DUBs确实具备切割Ub-RPL40的能力。

一个引人入胜的发现是，虽然GG/AA和L73P两种突变都阻碍了Ub-RPs的切割，但它们的蛋白稳定性却差异巨大：GG/AA突变体相对稳定，而L73P突变体则极易被降解。研究人员推测，这种差异可能源于它们与DUBs结合能力的不同。GG/AA突变可能仅破坏DUB的催化活性而不影响其结合，而L73P突变则同时削弱了DUB的结合。实验证实，GG/AA突变体能够有效地与USP7等DUBs结合，而L73P突变体的结合能力则弱得多。更重要的是，过表达USP7或OTUD7B，即使其催化活性丧失，也能显著稳定L73P Ub-RPs。这表明，DUBs可以通过其非催化性的物理结合，占据Ub-RPs上的位点，从而阻止UFD通路E3连接酶（如TRIP12和HUWE1）的接近和泛素化，起到"守护者"的作用。特别的是，CEZANNE/OTUD7B不仅能够以非催化方式稳定Ub-RPs，其催化结构域甚至能够切割L73P突变体，这是其他测试的DUBs（如USP7）所不具备的能力，提示了其独特的作用机制。

本研究主要运用了分子生物学技术构建了多种Ub-RP野生型及突变体质粒用于细胞表达和功能分析；通过蔗糖梯度超速离心技术分析了Ub-RPs在核糖体各组分中的分布；利用基于活性探针（ABPs）的蛋白质组学技术结合质谱分析，鉴定与Ub-RPs相互作用的DUBs和E3连接酶；采用免疫共沉淀、蛋白质印迹（Western Blot）和体外酶活分析（如UBICREST分析、体外泛素化和切割实验）验证了蛋白质相互作用、泛素链类型及酶活性；并运用RNA干扰（siRNA）和CRISPR-Cas9基因编辑技术敲低或敲除候选基因以验证其功能。研究所用细胞模型为人胚肾细胞（HEK293T）。

突变不同的泛素C末端残基可阻断Ub-RP的切割

研究人员设计了C末端带有HA标签的野生型Ub-RP、缺失泛素的突变体（ΔUb）以及两种切割抗性突变体（GG/AA和L73P）的表达载体。在HEK293T细胞中表达这些构建体后，蛋白质印迹分析显示，野生型Ub-RPs能够被有效切割，产生成熟的核糖体蛋白。而两种切割抗性突变体，尤其是L73P突变体，切割效率显著降低，且蛋白表达水平较低，ΔUb突变体的表达水平也较低，表明泛素融合对于RP的稳定表达是重要的。

切割抗性的Ub-RPs损害核糖体功能

通过蔗糖梯度沉降分析发现，虽然未切割的Ub-RPs能够被整合到核糖体亚基和80S核糖体中，但它们显著富集在核糖体亚基和80S组分，而几乎无法进入活跃翻译的多聚体组分中。这表明Ub-RPs的切割是核糖体行使正常翻译功能的前提。

未加工的Ub-RP融合蛋白通过UFD通路被链连接特异性的蛋白酶体降解

蛋白酶体抑制剂MG132实验表明，L73P Ub-RPs的降解依赖于蛋白酶体。通过构建泛素上所有赖氨酸突变为精氨酸（K0）的突变体，发现其能稳定L73P Ub-RPs。进一步的点突变回复实验表明，泛素模块上的K29和K48残基对于L73P Ub-RPs的降解至关重要。UBICREST分析证实连接在L73P Ub-RPs上的泛素链包含K29和K48连接。通过质谱分析和基因功能丧失实验，鉴定出E3连接酶TRIP12和HUWE1是介导这一降解过程的关键因子。体外实验证实TRIP12能够泛素化Ub-RPL40。

Ub-RP活性探针共价捕获DUBs

研究人员合成了基于Ub-RP的活性探针（Ub(1-75)-Dha-RPL40和Ub(1-75)-Dha-RPS27a），利用其从细胞裂解液中共价捕获并鉴定出一系列潜在的Ub-RP加工DUBs，包括USP7、USP9X、USP15以及新发现的CEZANNE/OTUD7B等。体外切割实验验证了这些DUBs的切割活性。

多种DUBs切割Ub-RPs，包括OTUD7B

体外切割实验显示，USP家族多个成员（如USP7、USP9X、USP15）以及CEZANNE/OTUD7B能够有效切割Ub-RPL40。而UCHL3有活性，UCHL1则没有检测到活性。ZRANB1和OTUB1虽能被探针标记，但体外切割实验为阴性，提示探针可能存在脱靶效应。

DUB结合可阻止UFD通路对Ub-RPs的降解

免疫共沉淀实验表明，GG/AA Ub-RP突变体比L73P突变体更能与USP7等DUBs结合。在细胞中过表达USP7或OTUD7B，即使其催化活性丧失，也能显著稳定L73P Ub-RPs，表明DUBs可以通过非催化性的物理结合来保护Ub-RPs免受UFD通路的降解。特别的，CEZANNE/OTUD7B的催化结构域能够切割L73P突变体，而USP7则不能。

本研究揭示了人类细胞中Ub-RP融合蛋白加工和稳定性调控的一个精细平衡模型。去泛素化酶（DUBs）在此过程中扮演了双重角色：一方面，它们催化切割Ub-RPs，释放出功能性的核糖体蛋白和游离泛素；另一方面，它们通过物理结合（非催化性）来保护未切割的Ub-RPs，使其免遭由TRIP12和HUWE1介导的、依赖于K29/K48泛素链的泛素融合降解（UFD）通路的降解。这种调控机制确保了核糖体蛋白的适时供应和核糖体功能的正常进行，同时将未能被及时加工的Ub-RP前体清除，以维持蛋白质稳态。该研究不仅将UFD通路的功能扩展到了内源性底物，还揭示了DUBs的一种非经典功能——通过底物占据来拮抗降解信号。这为理解泛素系统在协调蛋白质合成与降解这一核心细胞过程中的重要作用提供了新的视角，也可能为与核糖体功能失调或蛋白质稳态失衡相关的疾病研究提供新的思路。