来自Drynaria fortunei的Drynachromoside A通过体外和体内激活Nrf2来减轻糖尿病肾病的氧化应激和纤维化

《Redox Report》：Drynachromoside A from Drynaria fortunei attenuates oxidative stress and fibrosis of diabetic nephropathy via activating Nrf2 in vitro and in vivo

糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见并发症，研究显示Nrf2激活可减轻DN。本文从Drynaria fortunei中分离出新型化合物DCSA，通过体外细胞实验和db/db小鼠体内实验，证实DCSA通过Keap1依赖性激活Nrf2通路，抑制高血糖诱导的系膜细胞增殖，减少氧化应激（SOD、CAT、GPx活性提升）和肾纤维化（TGF-β1、ECM蛋白表达降低），并改善小鼠肾功能（FBG、BUN、Scr、UACR水平下降）。分子对接显示DCSA与Keap1的 Kelch结构域结合，揭示了其激活Nrf2的作用机制。

　　糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最常见的并发症之一，其发生机制复杂且具有高度的病理生理学特征。DN通常表现为肾功能逐渐恶化、蛋白尿以及肾小球结构的破坏，最终可能导致终末期肾病。目前，尽管临床中对DN的治疗主要依赖于严格控制血糖和血压，但这些措施并不能完全阻止疾病的进展，因此，探索新的治疗策略成为迫切需求。在这一背景下，核因子E2相关因子2（Nrf2）作为一种关键的转录因子，已被证明在调节抗氧化反应中起重要作用，而Nrf2的激活可能为DN提供新的治疗思路。

Nrf2是一种能够调控多种抗氧化酶基因表达的转录因子，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、血红素加氧酶-1（HO-1）以及NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）。在未受到外界刺激时，Nrf2主要与Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）结合，在细胞质中被泛素化并随后被降解。然而，当细胞暴露于氧化剂或亲电物质时，Keap1-Nrf2复合物会被破坏，Nrf2得以释放并进入细胞核，结合到抗氧化反应元件（ARE）区域，从而促进相关基因的表达，增强细胞的抗氧化能力。因此，Nrf2的激活在对抗氧化应激相关疾病中具有重要潜力，包括DN。然而，目前尚未有Nrf2激活剂被广泛用于DN的治疗，尽管合成的二氢姜黄素（bardoxolone）在临床试验中显示出显著的Nrf2激活效果，但由于其意外的心血管副作用，最终被终止。

本研究旨在从传统中药“骨碎补”（Drynaria fortunei）中发现新的Nrf2激活剂，并评估其对DN的潜在治疗作用。通过体外和体内实验，我们发现从骨碎补中提取的干姜黄素A（Drynachromoside A, DCSA）能够有效抑制高糖诱导的系膜细胞增殖，改善db/db小鼠的肾功能，并显著减轻氧化应激和肾纤维化。这些作用均与Nrf2的激活密切相关，且该激活过程依赖于Keap1的参与。

在体外实验中，我们首先通过细胞增殖实验评估了DCSA对高糖环境下系膜细胞的影响。结果显示，DCSA在10 μM浓度下能够显著抑制高糖诱导的系膜细胞增殖，同时并未对正常糖浓度下的细胞产生明显毒性。为了进一步验证DCSA的保护作用，我们还使用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测法评估了细胞的凋亡和氧化应激情况。实验结果表明，DCSA能够显著降低高糖条件下细胞内活性氧（ROS）的水平，并减少脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的积累，同时提升SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的活性，从而有效缓解氧化应激。

为了深入探讨DCSA的作用机制，我们还进行了Nrf2的激活实验。通过免疫荧光染色和Western blot分析，我们发现DCSA能够促进Nrf2从细胞质向细胞核的转移，并显著增加其在细胞核中的表达水平。进一步的双荧光素酶报告基因实验表明，DCSA能够增强Nrf2对ARE区域的结合能力，从而调控目标基因的表达。此外，我们还检测了Nrf2的下游靶点，包括HO-1和NQO1，发现DCSA能够显著提升这些酶的表达水平，表明其通过激活Nrf2发挥抗氧化作用。

为了验证Nrf2在DCSA作用中的关键性，我们进行了RNA干扰实验。当Nrf2被沉默后，DCSA对氧化应激和肾纤维化的保护作用显著减弱，这表明Nrf2的激活是DCSA发挥治疗效果的重要机制。同时，我们还利用分子对接技术，研究了DCSA与Keap1的相互作用。结果显示，DCSA能够进入Keap1的Kelch结构域，并与多个关键氨基酸残基形成氢键，同时通过π-π堆积、疏水作用和静电相互作用稳定其与Keap1的结合。这些结果进一步支持了DCSA通过Keap1依赖性机制激活Nrf2的假设。

在体内实验中，我们使用db/db小鼠模型评估了DCSA对肾功能的改善效果。db/db小鼠由于遗传性胰岛素抵抗，常被用作研究DN的模型。与正常db/m小鼠相比，db/db小鼠表现出更高的血糖水平、肾脏重量以及尿蛋白/肌酐比值（UACR）。通过H&E染色和Masson染色，我们观察到db/db小鼠肾脏存在明显的结构改变，包括肾小球基底膜增厚和系膜区扩张。然而，当给予DCSA治疗后，这些病理变化显著减轻，同时肾功能指标如血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）和尿蛋白水平均有所改善。此外，免疫组化实验显示，DCSA能够显著降低肾脏中TGF-β1的表达，而TGF-β1是导致肾纤维化的重要因子。这些结果进一步表明，DCSA能够通过激活Nrf2，减轻糖尿病小鼠的氧化应激和肾纤维化。

为了进一步验证DCSA对TGF-β1信号通路的影响，我们还检测了Smad3的磷酸化水平。Smad3是TGF-β1信号传导中的关键分子，其磷酸化水平升高与肾纤维化的发生密切相关。实验结果显示，DCSA能够显著降低高糖条件下Smad3的磷酸化水平，而Nrf2的沉默则逆转了这一效应。这表明DCSA通过激活Nrf2，抑制了TGF-β1信号通路，从而减少了ECM蛋白的合成和积累，延缓了肾纤维化进程。

此外，我们还发现，DCSA的保护作用在Nrf2被抑制后显著减弱，这进一步证明了Nrf2在DCSA治疗DN中的核心作用。同时，通过分子对接分析，我们明确了DCSA与Keap1的结合方式，并推测其可能通过非共价作用稳定Nrf2的激活状态，从而发挥其抗氧化和抗纤维化的作用。然而，由于实验条件的限制，我们尚未完全阐明DCSA与Keap1结合的具体模式，包括是否为共价结合或非共价结合。未来的研究将聚焦于这一方面，通过体外生物物理实验和构建特定的突变细胞系，进一步揭示DCSA与Keap1相互作用的详细机制。

综上所述，本研究首次从骨碎补中分离并鉴定出一种新的Nrf2激活剂——干姜黄素A（DCSA），并证实其在体外和体内均能有效缓解高糖诱导的氧化应激和肾纤维化。DCSA通过Keap1依赖的机制激活Nrf2，进而增强细胞的抗氧化能力，减少ECM蛋白的积累，改善肾功能。这一发现不仅为DN的治疗提供了新的思路，也为Nrf2激活剂的开发提供了重要的理论依据和实验支持。未来，随着对DCSA分子机制的进一步研究，有望将其发展为一种安全有效的抗糖尿病肾病药物。