在氢凝胶-空气界面培养猪呼吸道组织，以模拟囊性纤维化进展过程中的黏膜下腺体及其治疗

《SCIENCE ADVANCES》：Porcine airway tissue explant culture at a hydrogel-air interface to model submucosal glands in cystic fibrosis progression and therapy

本研究开发了AirTECH方法，通过氢胶-空气界面培养新生猪气道组织，成功维持14天内的正常结构、细胞组成和黏液-纤毛清除功能，为囊性纤维化气道疾病模型和基因治疗研究提供了新工具。

　　在空气道健康中，黏膜下腺体（submucosal glands, SMGs）扮演着至关重要的角色。然而，目前在体外复制其复杂的结构和功能仍面临诸多挑战。为了更好地理解SMGs在空气道疾病中的作用并探索治疗干预手段，研究团队开发了一种名为AirTECH的体外空气道组织培养方法。该方法利用新生猪的气管组织，将其放置于水凝胶-空气界面进行培养。经过14天的培养后，AirTECH组织不仅保持了SMGs的自然结构、细胞类型和基因表达，还保留了完整的表面上皮、平滑肌和软骨结构。此外，该方法还能够模拟空气道的防御功能，如黏液清除和抗菌作用。

SMGs在空气道防御和再生中具有关键作用，它们能够分泌大量的空气道表面液和抗菌蛋白/肽，从而保持空气道的湿润并消灭吸入的病原体。当面对环境挑战（如细菌和颗粒物）时，SMGs会分泌大量黏液，形成丝状结构，促进黏液-纤毛清除。此外，SMGs还作为干细胞储备库，在空气道受到损伤后能够再生上皮组织。然而，在囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）中，SMGs的功能受损，导致黏液阻塞、纤毛清除功能下降以及细菌清除能力减弱。因此，SMGs被认为是治疗空气道疾病的重要靶点。

尽管SMGs在空气道生物学和疾病中具有重要意义，但目前缺乏能够长期维持其结构和功能的体外模型。大多数关于SMGs的研究是在体内进行的，主要使用与人类SMGs相似的大哺乳动物模型，如豚鼠和猪。然而，体内研究存在诸多局限，包括实验复杂性、低通量、高成本以及环境干扰因素。相比之下，体外模型如类器官、球体和精确切割的空气道切片虽然能够提供一定的研究平台，但它们在维持SMGs的管状结构和整合功能方面存在不足。因此，研究团队开发了AirTECH方法，以克服这些限制。

在AirTECH模型中，通过将气管组织的基底侧嵌入Matrigel基质中，并将气道表面暴露于空气中，从而模拟体内空气-液体界面的环境。这种方法在标准的12孔板和Transwell插件中进行，以提高实验的通量。为了减少CF的二次疾病表现（如感染和炎症），研究团队使用了新生猪的气管组织。经过14天的培养，结果显示，SMGs的结构、细胞组成和基因表达均得到了有效保留。

在研究SMGs在CF疾病进展中的作用时，研究团队通过将Pseudomonas aeruginosa的脂多糖（LPS）暴露于AirTECH组织中，观察到异常的黏液积累和MUC5AC的过度表达，这些特征与CF空气道疾病一致。此外，AirTECH模型还用于研究SMGs在空气道基因治疗中的作用，其中绿色荧光蛋白（GFP）编码的腺病毒载体被转导并表达于空气道表面上皮细胞，但未在SMGs中表达。这一发现表明，SMGs在基因治疗中的作用可能与空气道上皮细胞不同。

为了进一步验证AirTECH模型的可行性，研究团队还进行了细胞凋亡和增殖的评估。结果显示，在新鲜组织和14天培养的AirTECH组织之间，细胞凋亡和增殖的信号几乎没有差异。此外，通过使用CoCl?诱导组织缺氧和凋亡，发现缺氧组的增殖标记物减少，而凋亡标记物增加。这表明，AirTECH组织在培养过程中并未出现显著的细胞凋亡现象。

通过批量mRNA测序，研究团队分析了AirTECH组织的基因表达情况。结果显示，新鲜组织和AirTECH组织中，超过97.5%的基因表达水平保持不变，仅有不到0.5%的基因被上调，而约2.04%的基因被下调。下调的基因涉及细胞对代谢变化的反应、细胞-基质相互作用、细胞发育和细胞运动等。尽管某些基因表达的变化可能与水凝胶和体内细胞外基质的差异有关，但总体而言，AirTECH组织在基因表达上与新鲜组织保持高度一致。

在研究SMGs的黏液-纤毛清除功能时，研究团队采用了一种黏液丝实验。结果显示，AirTECH组织能够维持黏液清除功能，并且该功能对氯离子/碳酸氢盐分泌和胆碱能激动剂（如甲基胆碱）的响应。通过比较不同缓冲液条件下的黏液积累情况，发现含有HCO??/CO?的Krebs-Ringer缓冲液能够显著减少黏液积累，而含有bumetanide的Hepes缓冲液则导致黏液积累增加。这表明，SMGs分泌的黏液在物理性质上可能受到离子运输的影响。

此外，研究团队还使用AirTECH模型探讨了SMGs在CF疾病进展中的作用。通过培养新生CF猪的气管组织，发现CF AirTECH组织能够维持正常的SMGs和表面上皮结构，并且在LPS刺激下表现出异常的黏液积累和MUC5AC过度表达。这与CF患者的痰液样本中观察到的特征相似。相比之下，野生型（WT）AirTECH组织在LPS刺激下并未表现出类似的MUC5AC过度表达，表明CF组织对LPS的反应与正常组织存在差异。

在基因治疗方面，AirTECH模型展示了其在空气道表面上皮细胞的特异性基因转导能力。通过使用GFP编码的腺病毒载体，研究团队发现GFP在表面上皮细胞中表达，但在SMGs中未检测到。这一结果表明，AirTECH模型能够实现对特定细胞类型的基因转导，从而有助于研究SMGs在CF病理生理学中的具体作用。同时，通过分析腺病毒受体CAR的表达，发现其在表面上皮和SMGs中均存在，但病毒无法穿透SMGs的结构，这可能与物理屏障有关。

尽管AirTECH模型在维持SMGs的结构和功能方面表现出色，但仍存在一些局限性。例如，该模型的培养条件与体内环境存在差异，如氧气和营养物质的输送可能受限，这可能影响SMGs的代谢活动。此外，目前的AirTECH模型未考虑体内呼吸周期中的机械应变和咳嗽等动态因素，这些因素可能影响离子通道功能和病毒或纳米颗粒的传递。未来的研究可能会探索更先进的水凝胶材料、脱细胞肺支架等，以进一步优化AirTECH模型。

综上所述，AirTECH模型为研究SMGs在空气道疾病中的作用提供了重要的工具。该模型不仅能够维持SMGs的结构和功能，还能模拟体内环境，从而支持对疾病机制和治疗策略的深入研究。通过AirTECH，研究者可以更全面地理解SMGs在CF等疾病中的角色，并探索针对性的治疗手段。这一方法的开发为空气道疾病的研究和治疗带来了新的希望。