维生素D代谢相关基因在反复妊娠丢失中的作用及其免疫微环境的变化

《Journal of Multidisciplinary Healthcare》：The Role of Vitamin D Metabolism-Related Genes in Recurrent Pregnancy Loss and Their Immune Microenvironmental Changes

维生素D代谢异常与复发性流产（RPL）的免疫微环境及分子机制研究。通过WGCNA筛选出27个候选基因，机器学习验证DOCK11和ETV2为关键生物标志物，表达显著异常并富集于炎症反应和TNAF信号通路。单细胞分析揭示NK细胞中DOCK11和ETV2高表达，与CD8+T细胞活化增强、巨噬细胞信号减弱相关。分子对接显示Calcitriol和8-Bromo-cAMP可能靶向调控这两类基因。研究为RPL的早期诊断和治疗提供了新靶点。

　　维生素D代谢在妊娠并发症中的重要性已经被广泛确认，但其在反复妊娠丢失（RPL）中的作用机制仍不明确。本研究通过生物信息学分析方法，旨在揭示维生素D代谢与RPL之间可能的分子机制，并识别潜在的生物标志物。研究结合了加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习、孟德尔随机化（MR）以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）等多种技术手段，为RPL的临床诊断和治疗提供了新的视角。

RPL是指在妊娠过程中，从受精卵形成到胚胎达到可存活状态或妊娠不足24周时发生两次或以上的流产现象。据流行病学研究显示，RPL的发生率约为1%至5%，并且随着中国全面实施三孩政策以及女性平均生育年龄的上升，其发生率正逐年增加。RPL的病因复杂多样，包括遗传因素、子宫解剖异常、内分泌紊乱、病毒感染、环境因素以及免疫相关因素等。由于RPL的具体原因尚未完全明确，临床干预措施相对有限，这使得寻找有效的生物标志物成为生殖医学领域的重要课题。

维生素D作为一种多功能类固醇激素，其作用远超传统的钙和磷代谢调节。近年来，维生素D在维持免疫稳态和抑制炎症反应中的作用引起了广泛关注。CYP2R1和核维生素D受体（VDR）是维生素D转化为其生物活性形式并介导相关功能的关键基因。活性代谢产物1,25-二羟基维生素D3（1,25(OH)?D?）通过与VDR结合，发挥广泛的生物学效应，并在多种组织中展现出显著的免疫调节作用。在妊娠早期，VDR在滋养层和蜕膜中的表达显著上调，同时1α-羟化酶（CYP27B1）的表达增加，从而激活维生素D。然而，与正常女性相比，反复流产女性的CYP27B1表达水平较低，提示CYP27B1表达减少可能与反复流产相关。此外，维生素D代谢在早产、妊娠糖尿病和子痫前期等妊娠相关问题中也起着重要作用。维生素D缺乏可能增加孕妇对某些病原体的易感性，从而导致呼吸系统疾病、结核病、流感以及新冠病毒感染，这些情况可能间接影响妊娠的稳定性。已有研究表明，维生素D缺乏与RPL风险增加密切相关。此外，维生素D缺乏还与NK细胞活性增强有关。然而，维生素D代谢如何影响RPL的发生及其潜在的分子机制仍有待深入探讨。

为了进一步探索RPL的复杂机制，研究团队采用单细胞RNA测序技术，以获取个体细胞层面的信息。RPL的高变异性及其多个发展阶段，使得scRNA-seq成为揭示其复杂过程的重要工具。通过整合多种生化技术，scRNA-seq能够从多个角度和层面深入分析与疾病相关的细胞。同时，孟德尔随机化（MR）分析作为一种新兴的因果关系研究方法，通过利用全基因组关联研究（GWAS）数据，测试暴露因素与疾病结局之间的因果关系。该方法不仅能够测量多个潜在生物标志物，还能够评估与暴露相关的其他特征。在本研究中，团队利用RPL的转录组数据，结合生物信息学方法，识别与维生素D代谢相关的生物标志物，并评估这些标志物的表达水平和诊断潜力。此外，团队还进行了富集分析和免疫浸润分析，以探讨这些生物标志物如何影响RPL的进展。在单细胞层面，团队进一步研究了生物标志物的表达情况，为RPL的临床预防和诊断提供了新的见解。

研究首先从公共数据库中获取了两个与RPL相关的转录组数据集，并应用了WGCNA方法，以识别与维生素D代谢相关的模块基因。通过比较RPL样本与对照样本，团队发现了379个差异表达基因（DEGs），其中包括167个上调基因和212个下调基因。WGCNA分析显示，有两个模块与维生素D代谢显著相关，即MEbrown模块和MEred模块。在这些模块中，基因与疾病之间的相关性达到0.3以上，且P值小于0.05。模块成员（MM）大于0.7且基因显著性（GS）大于0.65的基因被选为关键模块基因，共计970个。接下来，团队通过基因集富集分析（GO和KEGG）进一步分析了这些候选基因的功能和生物学机制，结果显示这些基因主要参与炎症反应、干扰素γ反应和NFKB介导的TNAF信号通路等过程。

在识别出关键模块基因后，团队利用机器学习算法筛选出潜在的生物标志物。通过LASSO回归分析和Boruta算法，团队确定了DOCK11和ETV2作为候选生物标志物。实验验证表明，这两个基因在RPL样本中呈现出一致的表达趋势，且在ROC分析中显示出较高的诊断价值。此外，MR分析并未发现这些生物标志物与RPL之间存在直接的因果关系，而是提示RPL的发生可能影响这些基因的表达。因此，这些生物标志物可能作为疾病过程中的下游效应分子，参与免疫微环境的重编程和胎盘功能的调节，而非直接驱动疾病的发生。这一发现进一步强调了RPL的复杂性和多因素性，提示未来研究应更加关注这些基因在疾病进展中的动态变化及其与其他风险因素的相互作用。

在免疫浸润分析方面，团队利用CIBERSORT算法和LM22基因集，计算了RPL样本和对照样本中22种免疫细胞的比例。结果表明，RPL患者与健康个体相比，某些免疫细胞的浸润水平发生了显著变化。具体而言，CD8 T细胞的浸润水平在RPL患者中较高，而记忆性静止CD4 T细胞、M2巨噬细胞和M1巨噬细胞的浸润水平则较低。此外，团队还通过Spearman相关性分析，探讨了免疫细胞与生物标志物之间的关系，发现DOCK11与激活的记忆性CD4 T细胞之间具有最高的相关性。这些结果表明，RPL患者的免疫微环境存在显著差异，而DOCK11和ETV2可能在其中发挥关键作用。

为了进一步揭示这些生物标志物的潜在分子机制，团队进行了基因集富集分析（GSEA），并结合免疫浸润分析和药物预测研究。GSEA分析结果显示，这些生物标志物在与RPL相关的信号通路中具有显著的富集效应，包括趋化因子信号、细胞动态受体相互作用和自然细胞毒性等。此外，团队还通过药物预测数据库，识别了可能针对DOCK11和ETV2的药物，并进行了分子对接分析，以评估这些药物与生物标志物的结合稳定性。例如，ETV2与普鲁喹啉和托拉唑啉的结合能分别为-6 kcal/mol和-5.1 kcal/mol，显示出稳定的相互作用。DOCK11与8-溴环磷腺苷和钙三醇的结合能分别为-8.7 kcal/mol和-7.6 kcal/mol，同样显示出良好的结合效果。这些药物的潜在临床应用为RPL的治疗提供了新的方向。

单细胞分析进一步揭示了RPL患者中不同的细胞簇分布。通过对CRA002181数据集的处理，团队识别了16个不同的细胞簇，并将其分类为11种细胞类型，包括细胞毒性CD8+ T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞、间充质干细胞、CD8+ T细胞、单核细胞、B细胞、树突状细胞、内皮细胞、T细胞和肥大细胞。分析显示，DOCK11和ETV2在NK细胞中显著富集，提示这些细胞可能在RPL的发病机制中发挥重要作用。此外，团队还探讨了不同细胞类型之间的信号传递和细胞间通信网络，发现RPL患者中NK细胞和细胞毒性CD8+ T细胞的信号输入增强，而巨噬细胞的信号输入则相对减弱。这种变化可能反映了疾病状态下免疫微环境的重新编程。

研究结果表明，DOCK11和ETV2的异常表达可能与RPL的发生密切相关。DOCK11属于DOCK蛋白家族，是整合素信号通路的关键组成部分。研究表明，DOCK1可以通过激活下游蛋白如ERK和AKT，促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。在RPL患者的胎盘绒毛中，DOCK1的表达显著降低，这与本研究中通过Western blotting验证的结果一致。然而，由于组织特异性，PCR结果未能显示显著差异。此外，DOCK1在其他妊娠相关疾病和恶性肿瘤中的作用也受到广泛关注。例如，在子宫内膜癌中，DOCK1通过c-Raf/ERK通路调节恶性生物学行为。在子痫前期中，DOCK1的缺乏会导致胎盘功能障碍，通过协调炎症反应和氧化应激影响胚胎发育。这些研究进一步支持了DOCK1在妊娠相关疾病中的重要性，表明其可能通过多种信号通路参与胎盘功能的调节和妊娠结局的维持。

ETV2作为一种关键的转录因子，在胚胎发育过程中对造血细胞系的分化起着重要作用。研究发现，ETV2在胚胎发育早期表达，特别是在E7.0阶段，其表达水平随后逐渐下降。在E7.75阶段，ETV2参与了卵黄囊中造血内皮细胞的发育。ETV2的突变会导致胚胎无法存活，因为造血干细胞（HSCs）和内皮细胞的丧失。此外，ETV2的过表达可以诱导小鼠胚胎中Flk1+间充质细胞的形成，并通过减轻BMP、Notch和Wnt信号通路的抑制作用，促进这些细胞向HSCs和内皮细胞分化。在Zhao等人的研究中，ETV2、VEGF和FLK1的相互作用被发现可以诱导和调控血管再生。在成年小鼠后肢缺血损伤后，ETV2在内皮细胞中的表达被重新激活，通过调节VEGF/FLK1信号通路促进血管再生。Xu等人发现，ETV2在造血干细胞/前体细胞中的表达在骨髓移植或HSC损伤后被活性氧（ROS）激活，从而促进这些细胞的自分泌、迁移和再生。有趣的是，研究还发现，c-Kit的表达可以缓解ETV2缺失导致的造血干细胞/前体细胞增殖缺陷和短期骨髓移植失败。本研究发现，ETV2在RPL患者的子宫内膜组织中表达水平较低，这与其在胚胎发育和血管生成中的关键作用相一致。ETV2的低表达可能导致胎盘血管生成障碍，从而影响正常的胚胎发育。这一发现提示ETV2可能在RPL的发生中发挥重要作用，通过调控血管生成和胎盘功能影响妊娠结局。

在药物预测和分子对接分析中，团队发现了一些可能针对DOCK11和ETV2的药物，包括托拉唑啉、普鲁喹啉、8-溴环磷腺苷和钙三醇。托拉唑啉是一种非选择性α-肾上腺素能受体拮抗剂和血管扩张剂，已被用于治疗新生儿脑病和肺出血。普鲁喹啉主要用于治疗疟疾，通常与其他疗法如氯喹或青蒿素类药物联合使用，以针对寄生虫的生殖活跃形式。8-溴环磷腺苷是一种细胞渗透性cAMP类似物，可以作为cAMP依赖性蛋白激酶的激活剂。钙三醇是维生素D的活性激素形式，是调节矿物质和骨骼代谢的关键因子。此外，钙三醇还能调控生长和细胞分化，调节激素分泌，并影响生殖功能。钙三醇还能刺激人胎盘中雌二醇和孕酮的合成。此外，作为免疫抑制剂，钙三醇能够调节多种细胞因子的合成，包括蜕膜催乳素，这可能有助于胎儿胎盘单位的建立。因此，钙三醇因其明确的临床安全性，具有潜在的临床转化研究价值。尽管其他化合物在分子对接分析中显示出良好的结合稳定性，但这些药物仍需通过临床前研究和临床试验进一步验证，为未来开发新的治疗策略提供方向。

本研究发现，DOCK11和ETV2在RPL患者的子宫内膜组织中异常表达，并具有良好的诊断价值，这提示它们可能作为临床辅助诊断的生物标志物。未来，通过检测这些基因在子宫内膜组织中的mRNA或蛋白表达水平，可以建立更准确的RPL风险分层模型，以识别高风险人群并实施早期干预。然而，本研究也存在一些局限性。首先，由于RPL患者的样本量较小，且公共数据集的获取有限，验证数据集GSE26787仅包含5个RPL样本，这可能限制了研究结果的普遍性和应用性。其次，尽管研究团队在使用公共数据集时采取了严格的标准化流程，以减少干扰，但样本的收集和处理过程中固有的异质性仍可能影响研究结果的稳定性。为了提高研究结果的稳健性和广泛适用性，未来的研究应致力于增加样本量，引入更多的公共数据集，并纳入多中心、多民族的独立队列。此外，由于本研究主要依赖于欧洲人群的GWAS数据进行MR分析，未来需要验证其在东亚人群GWAS数据中的普遍性。最后，由于本研究中发现的分子指标较为新颖，其在RPL中的精确作用尚未完全阐明，因此需要进一步的体外和体内验证，以深入探讨其潜在的诊断或治疗价值，从而推动RPL的基础和临床研究。