环境监测与设备卫生管理，以降低基于土壤的受控环境农业系统中李斯特菌的风险

《Applied and Environmental Microbiology》：Environmental monitoring and equipment sanitation to mitigate Listeria risks in a soil-based controlled environment agriculture system

可控环境农业（CEA）中李斯特菌污染风险研究。该设施通过1年环境监测（169样本）发现，李斯特菌 monocytogenes 仅在1份靴套样本中检出（0.59%），而李斯特菌 innocua 存在于收获托盘和结构表面。靴套采样有效指示环境污染，但收获托盘清洁后仍残留李斯特菌，尤其在粗糙表面。研究强调需优化清洁流程（如增加碱液洗涤和 sanitizers）并加强监测（多采样点、分子验证）。

　　在现代农业中，受控环境农业（Controlled Environment Agriculture, CEA）正逐渐成为保障全年新鲜食品供应的一种重要手段。这种技术通过在封闭或半封闭环境中精确控制温度、湿度、光照等条件，实现对作物的高效培育，同时减少外界环境对作物的干扰。然而，尽管CEA系统在保护作物免受外部污染方面具有显著优势，但其内部却可能产生新的食品卫生挑战，尤其是在设备清洁与消毒方面。本研究聚焦于一个基于土壤的CEA设施，通过为期一年的环境监测（Environmental Monitoring Program, EMP）分析了*Listeria monocytogenes*及其相关菌种在该系统中的存在情况和持久性，旨在评估其对食品安全的潜在影响，并探索改进清洁与消毒措施的有效途径。

研究团队从15个采样点收集了169个样本，包括婴儿叶类蔬菜、土壤、灌溉水以及设备表面的拭子样本。这些样本被分为三组，分别在2023年5月（EM1）、2023年10月（EM2）和2024年4月（EM3）进行采集。值得注意的是，在所有样本中，仅有一个样本（0.59%的检出率）检测到了*Listeria monocytogenes*，而*Listeria innocua*则在收获托盘和结构表面被分离出来，共3个样本（169个样本中的3个）。这一结果表明，尽管*Listeria monocytogenes*在该设施中并不常见，但其相关菌种仍可能成为潜在的污染源。

为了确认这些菌种的种类并进一步分析其特性，研究采用了多种分子生物学技术。首先，通过聚合酶链式反应（PCR）检测了*sigB*、*iap*和*hly*基因，这些基因与*Listeria*属细菌的特性相关，其中*hly*基因是*Listeria monocytogenes*的一个毒力标志。随后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对23个代表性菌株进行了初步鉴定，结果显示其中13个菌株可以被高置信度地识别为*Listeria*属细菌。最后，通过全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）进一步验证了菌株的种类，确保了检测结果的准确性。在EM3中，一个样本被确认为*Listeria monocytogenes*，这表明在特定条件下，该菌种仍可能存在于环境中。

在分析收获托盘的清洁效果时，研究发现尽管清洁流程在一定程度上减少了微生物负荷，但其效果并不显著。在清洁前，收获托盘的平均微生物负荷为5.82 log CFU/托盘（标准差为0.66），而在清洁后，该数值降至5.62 log CFU/托盘（标准差为0.62）。这种微小的差异可能表明当前的清洁流程在去除顽固污染物方面存在不足。此外，*Listeria innocua*在清洁后的托盘表面未能被有效清除，这提示我们可能需要更深入的清洁措施来减少微生物残留的风险。在模拟清洗实验中，研究人员发现即使在24小时后，*Listeria innocua*仍能在清洁后的托盘表面存活，并且其存活率与表面粗糙度密切相关。粗糙或损坏的表面更容易成为细菌附着和形成生物膜的场所，这进一步增加了污染的可能性。

研究还探讨了清洁和消毒流程对微生物控制的实际效果。在实验中，未清洗的托盘在24小时后仍然显示出较高的微生物负荷，而清洗后的托盘虽然微生物数量有所减少，但并未达到理想水平。这说明，仅仅依靠常规清洗可能不足以彻底消除微生物污染。此外，研究团队通过对比不同清洁方式（如使用碱性清洁剂和消毒剂）对微生物负荷的影响，发现当前的清洁流程在去除土壤和有机物残留方面存在局限性。因此，未来的研究应着重评估更全面的清洁方案，包括使用高效消毒剂和优化清洗时间与强度，以提高微生物控制的效果。

在评估*Listeria*属细菌的生存能力时，研究采用了两种方法：培养法和分子检测法。通过培养法，研究人员能够观察到*Listeria innocua*在未清洗的托盘表面在24小时内仍能存活，并且即使经过水洗，其存活率依然较高。相比之下，使用分子检测法（如v-qPCR）可以更准确地检测到活菌，避免了传统培养法可能遗漏的不可培养菌株（Viable but Non-Culturable, VBNC）。这一发现对于食品安全管理具有重要意义，因为它表明即使在常规清洁后，某些细菌仍可能以不可培养的形式存在于设备表面，从而构成潜在的污染风险。

此外，研究还强调了环境监测在CEA系统中的关键作用。通过定期采集样本，可以及时发现污染源并采取相应的防控措施。例如，研究发现靴子覆盖物是检测环境中潜在污染源的有效工具，其能覆盖较大的面积，并且能够收集土壤、水残留和植物碎片等污染物。这种采样方法在高流量区域和土壤与设施接触点尤为重要，因为它能够提供更全面的环境信息，帮助研究人员识别污染传播的可能途径。

在讨论部分，研究团队指出，尽管*Listeria monocytogenes*在该设施中的检出率较低，但其相关菌种的存在仍提示需要加强环境监测和清洁措施。*Listeria innocua*的持久性表明，当前的清洁流程可能不足以完全消除微生物污染，尤其是在设备表面存在有机物残留的情况下。因此，未来的CEA设施应考虑采用更严格的清洁标准，包括定期深度清洁和使用更高效的消毒剂，以减少微生物在设备表面的附着和传播。

为了提高环境监测的效率和准确性，研究建议未来的监测计划应采用风险导向的长期设计，增加采样强度和空间覆盖范围。同时，标准化采样方法，如记录拭子面积、行走路径长度和洗脱体积，有助于更精确地评估清洁效果。此外，结合传统培养法和分子检测技术（如qPCR和WGS）可以提供更全面的数据，帮助研究人员追踪污染源并评估其传播路径。

在方法部分，研究详细描述了样本采集和处理的流程。所有样本均在实验室进行处理，确保检测的准确性和可靠性。样本包括作物、灌溉水、土壤、土壤改良剂、设备表面和收获托盘。为了提高检测的代表性，研究团队在EM1和EM2中采集了3个重复样本，而在EM3中增加了至5个重复样本。样本的处理过程包括使用选择性培养基（如OCLA和MOX）进行初步筛选，随后通过PCR和MALDI-TOF MS进行进一步确认。全基因组测序则用于更深入的菌株分析，确保检测结果的准确性。

研究还探讨了*Listeria*属细菌的基因型和进化关系。通过WGS分析，研究人员确认了EM3中检测到的*Listeria monocytogenes*菌株属于Lineage II，Sequence Type (ST) 155，这一基因型在食品和环境样本中较为常见，但在临床病例中较少见。这表明该菌株可能来源于环境，而非人类宿主。此外，研究发现一些样本未能与*Listeria monocytogenes*参考基因组匹配，这可能是由于基因组多样性或检测方法的局限性所致。因此，结合多种检测方法和分析工具对于全面了解微生物的分布和特性至关重要。

最后，研究团队提出了未来研究的方向和建议。首先，应加强对CEA设施中微生物污染的监测，特别是在设备表面和高流量区域。其次，需要优化清洁和消毒流程，确保能够有效去除土壤和有机物残留。此外，未来的研究应考虑使用更先进的检测技术，如全基因组测序和分子生物学方法，以提高污染检测的敏感性和特异性。最后，建议制定标准化的环境监测方案，确保不同设施之间的可比性，并为食品安全管理提供科学依据。

综上所述，本研究揭示了基于土壤的CEA系统中微生物污染的潜在风险，特别是在收获设备和结构表面。尽管*Listeria monocytogenes*的检出率较低，但其相关菌种的存在仍提示需要加强清洁和消毒措施，以防止污染的传播。同时，研究强调了环境监测在CEA系统中的重要性，并提出了改进监测方法和清洁流程的建议，以提高食品安全水平并确保生产环境的清洁度。这些发现不仅对当前的CEA设施具有指导意义，也为未来的食品安全研究提供了新的思路和方向。