土壤微生物中C-糖基化异黄酮普瑞兰（puerarin）初始降解机制的特性研究

《Applied and Environmental Microbiology》：Characterization of the initial degradation mechanism involved in C-glycosylated isoflavone puerarin in soil microorganism

土壤中降解芦丁的Paenarthrobacter sp. No. 37及其代谢酶PurA和PurBC的发现，揭示了C-糖苷酶在自然环境中的新型功能。研究证实PurA是首例具有C8-OH氧化活性的FAD依赖性氧化酶，可催化C6和C8-糖苷化黄酮的氧化，PurBC则通过C-C键裂解完成脱糖。酶活性受pH 7-8和温度30-40℃优化，金属依赖性不同于肠道菌群中的DgpABC酶系。比较基因组学显示PurABC同源物广泛分布于放线菌门和变形菌门，为植物次生代谢产物降解研究提供新视角。

　　在自然环境中，微生物对植物产生的化合物进行分解和转化，是地球生物地球化学循环中的重要环节。这些化合物在植物体内通常以糖苷化形式存在，这种形式不仅增强了其稳定性，还提高了其在水中的溶解性。然而，当这些化合物被释放到环境中时，它们的代谢过程仍然充满未知。本研究关注的是异黄酮类化合物——葛根素（puerarin）的代谢途径，这是一种在中药“葛根汤”中发现的重要成分，广泛用于治疗感冒的初期阶段。研究发现，肠道细菌可以去除葛根素中的糖基部分，但这些能够分解C-糖苷的微生物在自然环境中尚未被发现。因此，我们通过土壤筛选方法，成功分离出一种能够分解葛根素的微生物，并明确了其分解过程中的两个关键步骤。

### 土壤中葛根素降解微生物的发现

为了寻找能够降解葛根素的微生物，我们从日本茨城大学周边的土壤样本中进行筛选。通过富集培养法，我们获得了多种能够在以葛根素为唯一碳源的培养基上生长的微生物。在这些微生物中，编号为No. 37的菌株表现出最强的葛根素降解能力。通过对该菌株的16S rRNA基因序列分析，我们发现其与“假交替单胞菌”（*Paenarthrobacter*）属的菌株具有高度相似性，表明该菌株可能属于这一属。这是首次从土壤中分离出能够分解C-糖苷的细菌，为理解自然环境中C-糖苷的代谢提供了新的视角。

### 葛根素降解的两个步骤

葛根素是一种C8-糖苷化的异黄酮，其降解过程分为两个主要步骤。第一步是由一种依赖黄素腺苷的氧化酶（PurA）催化，将糖基部分进行氧化反应。这一过程将葛根素转化为3″-酮-葛根素及其异构体。第二步则是由一种C-糖苷裂解酶（PurBC）催化，将糖基与异黄酮骨架之间的C-C键断裂，最终释放出非糖基部分——大豆苷（daidzein）。这一过程的发现表明，土壤中的细菌与肠道微生物在葛根素的降解机制上存在显著差异，说明自然环境中存在不同于肠道菌群的降解微生物。

### 菌株No. 37的代谢特性

菌株No. 37不仅能够以葛根素作为唯一的碳源进行生长，还表现出在培养基中加入葛根素后降解活性被诱导的特性。这表明，葛根素的降解是一个可调节的生理过程，可能受到环境因素的影响。此外，我们通过基因组测序和酶活性分析，确认了PurA和PurBC这两个关键酶的存在。PurA的分子量约为47.8 kDa，而PurBC则由PurB和PurC两个亚基组成，分子量分别为38.3 kDa和15.0 kDa，共同形成一个异二聚体。这一发现进一步揭示了PurBC在催化过程中可能的协同作用。

### 酶活性的测定与优化

为了进一步研究PurA和PurBC的特性，我们进行了详细的酶活性测定。PurA在30°C时表现出最高活性，而其在40°C时仍保持80%的活性，但在50°C以上则完全失活。这表明PurA的最适反应温度较低，且其活性受温度影响较大。另一方面，PurBC在40°C时活性最强，而在60°C以上则完全失活，说明其对高温的耐受性较差。此外，我们还研究了这两种酶在不同pH值下的活性变化，发现PurA在pH 7.5–8.3范围内保持最佳活性，而PurBC在pH 7.5–8.3时也表现出接近100%的活性，但在pH 6和pH 10时几乎无活性。这些结果表明，这两种酶的活性受到环境pH值的显著影响，其反应条件需要精确调控。

### 金属离子对酶活性的影响

金属离子在许多酶反应中扮演着重要角色，因此我们研究了不同金属离子对PurA和PurBC活性的影响。结果显示，PurBC在去除螯合剂后，其活性可以被Mn2?、Mg2?和Co2?部分恢复，而Cu2?和Zn2?则完全抑制其活性。相比之下，肠道细菌中的相关酶（如DgpBC）对Ni2?、Zn2?、Cu2?和Fe2?表现出更强的依赖性，而CarBC则主要依赖Mg2?。这种金属离子偏好性的差异可能反映了不同微生物来源的酶在进化过程中适应了不同的环境条件，从而在结构和功能上表现出独特的特性。

### 酶的底物特异性分析

为了深入了解PurA和PurBC的底物范围，我们对多种C-糖苷和O-糖苷进行了测试。PurA能够氧化C6-和C8-糖苷化的黄酮类化合物，这与之前报道的C-糖苷氧化酶不同，后者仅对C6-糖苷化化合物有效。这一发现表明，PurA具有更广泛的底物特异性，可能在未来的C-糖苷转化研究中具有重要应用价值。另一方面，PurBC仅对3″-酮-葛根素、3″-酮-木犀草素和3′-酮-大黄素等C8-糖苷化化合物表现出活性，说明其底物特异性与C-糖苷的糖基位置密切相关，而非其非糖基部分的结构。

### 微生物在自然环境中的作用

本研究不仅揭示了土壤微生物在葛根素代谢中的关键作用，还提供了关于C-糖苷代谢机制的新见解。我们发现，PurABC基因簇在多个不同的微生物类群中广泛存在，包括土壤细菌和与人类相关的微生物，如血清和尿液中的菌群。这一发现表明，C-糖苷代谢可能是一个在自然界中普遍存在的过程，而不仅仅局限于肠道环境。此外，与肠道微生物中的DgpABC相比，PurABC在自然环境中更为常见，说明土壤细菌可能在C-糖苷的降解中发挥更重要的作用。

### 研究的意义与展望

本研究的重要性在于，它首次揭示了土壤微生物对C-糖苷的降解能力，并明确了这一过程中的关键酶及其作用机制。这一发现不仅有助于理解自然环境中植物次生代谢产物的代谢路径，还可能为开发新的生物转化方法提供理论依据。例如，PurA的广谱底物特异性使其在合成非糖基化合物方面具有潜在的应用价值。此外，土壤微生物的广泛分布也意味着它们可能在生态系统的物质循环中扮演重要角色。未来的研究可以进一步探索这些酶在不同环境中的功能，以及它们在工业生物转化中的应用潜力。