用于调控嗜热醋酸生成菌Thermoanaerobacter kivui核心代谢途径的糖诱导型启动子

《Applied and Environmental Microbiology》：Sugar-inducible promoters for manipulation of core metabolic pathways in the thermophilic acetogen Thermoanaerobacter kivui

本研究以高温醋酸菌Thermoanaerobacter kivui为对象，通过RNA测序和定量PCR分析发现其糖代谢相关基因具有糖诱导型启动子特征。利用β-半乳糖苷酶报告系统筛选出两种高效的糖诱导型启动子（P_mann和P_fru），并成功应用于敲低Ech1质子泵复合体和WLP代谢途径关键基因（fhs）。实验表明，敲低突变体在非诱导糖（如葡萄糖）条件下生长显著受阻，而诱导条件下代谢正常，证实了这些启动子的可控性。该研究为代谢工程中定向调控醋酸菌代谢通路提供了新工具。

　　### 生物化学与代谢工程的进展：利用可诱导启动子研究热厌氧菌中的关键代谢基因

在生物化学和代谢工程领域，研究微生物如何高效地利用碳源并进行能量转换，一直是推动绿色生物制造技术发展的重要方向。特别是厌氧细菌，因其独特的代谢路径和对极端环境的适应能力，受到了广泛关注。其中，**醋酸菌（acetogenic bacteria）** 是一个重要的研究对象，它们通过**Wood-Ljungdahl路径（WLP）** 固定二氧化碳，这一过程在能量效率方面具有显著优势。近年来，科学家们致力于探索这些微生物在工业合成气（syngas）转化中的潜力，特别是在高温环境下的应用。然而，由于某些关键代谢基因的**必需性**，传统的基因敲除方法在研究其功能时存在局限性。因此，寻找能够**特异性调控**这些基因的可诱导启动子，成为推动研究的重要策略。

以**Thermoanaerobacter kivui** 为例，这是一种耐高温的醋酸菌，其最适生长温度为66°C，是目前已知的最耐热的醋酸菌之一。T. kivui 能够利用合成气中的氢气、一氧化碳和二氧化碳，并且还能以一些简单的糖类（如葡萄糖、果糖、甘露糖）和糖醇（如甘露醇）作为碳源。然而，T. kivui 中的某些关键基因，如编码 Ech1 复合物的基因簇，因无法通过传统的基因敲除方法进行有效研究，而其功能在很大程度上仍不清楚。为了克服这一难题，研究团队采用了一种创新的方法，即通过替换这些基因的启动子为可诱导的启动子，从而实现对基因表达的**可控性**。

#### 可诱导启动子的筛选与应用

为了找到适合 T. kivui 的可诱导启动子，研究人员首先对 T. kivui 在不同糖类（葡萄糖和甘露醇）下的**全局转录分析**进行了研究。通过**RNA测序**，他们发现了一些与糖类代谢相关的基因表达模式。这些基因在特定糖类存在时显著上调，而在没有该糖类时则保持低表达水平。例如，**甘露醇代谢基因簇（TKV_c02830-60）** 在甘露醇存在时表达水平提高约五倍，而**果糖代谢基因簇（Tkv_c23150）** 在果糖存在时表达水平更高，达到**250倍**的上调。这一发现表明，**糖类诱导的启动子**在调控代谢基因方面具有显著潜力。

进一步的实验中，研究人员利用**β-半乳糖苷酶（β-gal）** 作为报告基因，测试了这些启动子在 T. kivui 中的表达能力。β-gal 是一种常用的报告基因，能够帮助研究人员直观地评估基因表达水平。然而，由于 T. kivui 是一种厌氧菌，传统的荧光报告基因系统（如 GFP）无法在无氧条件下正常工作。因此，研究团队选择了**β-gal**，因为它能够在高温条件下保持活性，并且适用于厌氧环境。实验结果显示，**果糖启动子（Pfru）** 和 **甘露醇启动子（Pman）** 均能有效驱动 β-gal 的表达，但其中 Pman 的诱导效果更为显著。此外，**葡萄糖启动子（Pslp）** 也表现出较强的表达能力，尽管其表达水平略低于 Pman。

#### 关键代谢基因的“敲低”实验

在确认了这些可诱导启动子的功能后，研究人员将其用于**关键代谢基因的“敲低”实验**。例如，**Ech1** 和 **WLP基因簇** 都是醋酸菌代谢过程中的重要组成部分，但它们的基因敲除往往会导致细胞无法正常生长，因此传统方法难以研究其功能。通过替换 Ech1 基因簇的启动子为 Pman 或 Pfru，研究人员成功构建了**敲低菌株**，并观察其在不同糖类条件下的生长情况。实验结果显示，**在非诱导条件下（如葡萄糖）**，敲低 Ech1 的菌株表现出显著的生长缺陷，这表明 Ech1 在代谢过程中具有重要作用。同样，敲低 WLP 基因簇的菌株在葡萄糖培养条件下积累了更多的**甲酸**，进一步支持了这些基因在代谢中的关键地位。

这些结果不仅验证了可诱导启动子在调控关键代谢基因方面的有效性，也为未来的研究提供了新的工具。通过使用这些启动子，科学家们可以更灵活地控制基因表达，从而在不同的代谢条件下研究基因的功能。此外，这种方法还可以用于**代谢工程**，通过调整基因表达水平，优化微生物的代谢路径，提高目标产物的产量。

#### 醋酸菌在工业合成气转化中的应用潜力

醋酸菌在工业上的应用潜力主要体现在其对**合成气（syngas）** 的利用能力上。合成气是一种由氢气、一氧化碳和二氧化碳组成的混合气体，常来源于生物质气化或煤的气化过程。由于醋酸菌能够在高温下生长，且具有较高的代谢效率，因此它们被认为是合成气转化的理想候选者。然而，目前的研究主要集中在**常温醋酸菌**，而对耐高温醋酸菌的研究仍较为有限。

T. kivui 由于其**高温适应性**和快速的生长速率（在 H?+CO? 条件下，其倍增时间不足2小时），被认为是**高温合成气转化**的潜在生物催化剂。研究团队通过构建可诱导启动子，不仅能够研究其代谢路径，还能探索如何通过调控关键基因的表达，提高其在合成气转化中的性能。例如，通过**减少 Ech1 的表达**，可以降低细胞的生长速率，从而在生产阶段获得更高的产物浓度。这种方法在工业应用中具有重要意义，因为**减少细胞生长**有助于提高目标产物的**产量和纯度**。

#### 基因调控与代谢路径的协同作用

在醋酸菌的代谢过程中，**能量转换**和**碳固定**是紧密相关的两个环节。WLP 是醋酸菌固碳的核心路径，而 Ech 复合物则是连接 WLP 与能量转化的关键媒介。研究团队通过构建敲低菌株，观察到在非诱导条件下，Ech1 的表达水平显著降低，而 WLP 基因簇的表达也受到影响。这表明，Ech1 和 WLP 之间可能存在某种**协同调控**机制，确保代谢过程的高效进行。

此外，研究团队还发现，**糖类代谢基因簇**与 WLP 基因簇之间可能存在一定的**基因调控网络**。例如，甘露醇代谢基因簇中的某些基因在葡萄糖存在时被显著抑制，而果糖代谢基因簇则表现出较强的表达能力，即使在葡萄糖存在的情况下也能保持一定的活性。这一现象可能与**碳代谢的调控机制**有关，即细胞在不同碳源存在时，会优先利用高能量效率的碳源，并对其他碳源进行**代谢抑制**。

#### 未来的研究方向与技术改进

尽管本研究已经成功建立了可诱导启动子，并验证了其在调控关键代谢基因方面的有效性，但仍有一些挑战需要克服。例如，**可诱导启动子的诱导效率**可能受到多种因素的影响，包括诱导物的浓度、细胞的生长状态以及基因的表达背景。此外，由于 T. kivui 是一种耐高温的厌氧菌，其基因表达调控机制可能与其他微生物有所不同，需要进一步研究。

未来的研究可以集中在以下几个方面：
1. **寻找更高效的可诱导启动子**：目前研究中使用的 Pman 和 Pfru 虽然能够有效驱动基因表达，但其诱导效率仍有提升空间。通过筛选其他糖类或非糖类诱导物，可以进一步优化启动子的性能。
2. **探索非糖类诱导的调控机制**：虽然糖类诱导是目前研究的重点，但某些微生物可能具有其他类型的可诱导启动子，例如通过**铁缺乏**或**其他环境信号**进行调控。这些启动子可能在某些特定条件下具有更广泛的应用前景。
3. **构建更复杂的代谢调控系统**：除了单独调控 Ech1 或 WLP 基因簇外，还可以尝试构建**多基因调控系统**，通过同时调控多个基因的表达，进一步优化代谢路径。
4. **提高报告基因的灵敏度**：虽然 β-gal 在高温条件下表现出一定的活性，但其灵敏度仍低于荧光报告基因。因此，开发适用于厌氧环境的**新型报告基因**，将有助于更精确地评估基因表达水平。

#### 总结与意义

本研究通过构建可诱导启动子，成功实现了对 T. kivui 中关键代谢基因的调控，为深入理解醋酸菌的代谢机制提供了新的工具。此外，这种方法还为**工业代谢工程**提供了重要的支持，特别是在合成气转化和绿色化学品生产方面。通过调控基因表达，可以优化微生物的代谢路径，提高产物的产量和纯度，从而推动可持续生物制造技术的发展。

总之，这一研究不仅揭示了 T. kivui 中某些关键代谢基因的功能，还为未来的研究和应用提供了新的思路和方法。随着对可诱导启动子的进一步优化和基因调控系统的完善，醋酸菌在工业上的应用前景将更加广阔。