综述：揭示隐藏的：建立针对疟原虫肝期感染的免疫力

《TRENDS IN Parasitology》：Exposing the hidden: establishing immunity to Plasmodium liver stage infection

本综述聚焦于疟疾防治的关键突破口——肝期疟原虫。文章系统阐述了肝期疟原虫（Plasmodium falciparum）的生物学特性及其在肝细胞内的免疫逃逸策略，重点探讨了由抗原呈递细胞（APCs）交叉呈递肝期抗原、CD8+ T细胞（特别是组织驻留记忆CD8+ TRM细胞）介导的细胞免疫应答在建立长效保护性免疫中的核心作用。作者强调，基于全孢子（如晚期停滞的基因减毒寄生虫GAPs和药物减毒寄生虫DAPs）的疫苗策略，因其能诱导更广泛的免疫应答，展现出优于传统亚单位疫苗（如靶向CSP的RTS,S和R21）的应用前景，为最终实现疟疾的根治提供了新方向。

　　

隐藏的疟疾肝期

疟疾，这种由疟原虫（Plasmodium）引起的古老疾病，至今仍是全球重大健康威胁，其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）导致的死亡占绝大多数。在引起症状性血期感染之前，疟原虫必须首先在肝脏中发育，这个大约持续6-7天的“隐藏”阶段是寄生虫生命周期中的关键瓶颈，也是干预的理想靶点。阻断寄生虫通过肝期的入口或出口，既能预防疾病，也能阻止后续传播。

疟原虫肝期生物学

感染始于雌性按蚊叮咬时注入的孢子体（sporozoites）。这些孢子体穿过皮肤，进入血液循环，最终抵达肝脏。它们穿过肝血窦，通过细胞穿越或旁细胞途径进入肝实质，并最终成功侵入一个肝细胞（hepatocytes）。在肝细胞内，孢子体位于由宿主细胞膜改造而成的寄生泡（parasitophorous vacuole, PV）内，开始其肝期发育。

肝期发育始于孢子体去分化为具有复制能力的滋养体（trophozoite）。随后，滋养体通过一种非典型的有丝分裂——裂殖生殖（schizogony）进行大量增殖，形成多核的裂殖体（schizont）。最终，裂殖体分化产生数万个裂殖子（merozoites）。寄生泡破裂后，裂殖子以裂殖体囊（merosomes）的形式进入血流，感染红细胞，开启血期感染。

肝脏中对疟原虫感染的免疫应答

肝脏独特的免疫耐受环境使其成为病原体入侵的“特权”门户。然而，机体仍能通过细胞内在免疫和细胞免疫应答来清除肝期寄生虫。

受感染肝细胞内的免疫应答

肝细胞本身具备清除寄生虫的机制。例如，RIG-I样受体（RLRs）可感知寄生虫来源的双链RNA，激活线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）通路，驱动I型干扰素（IFN）信号传导，从而限制寄生虫负荷。I型干扰素可能通过上调干扰素刺激基因（ISGs），如促进活性氧（ROS）积累的NADPH氧化酶（NOX），进而通过非经典自噬或铁死亡（ferroptosis）等途径清除寄生虫。

自噬（autophagy）过程在肝期感染中扮演着双重角色。寄生虫劫持宿主自噬相关蛋白8（ATG8）家族蛋白以从宿主细胞 scavenge 营养；然而，在干扰素（如IFN-γ）信号增强的情况下，自噬平衡可能转向利于寄生虫清除，例如通过促进ATG8家族蛋白在寄生泡膜（PVM）的富集，导致溶酶体融合和寄生虫消亡。铁死亡作为一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，也被发现其关键调控通路影响肝期寄生虫负荷，但其直接清除作用尚待证实。

程序性细胞死亡也是清除途径之一。吡咯凋亡（pyroptosis）可由AIM2炎性体（感知胞质dsDNA）激活，导致Gasdermin蛋白切割形成膜孔和细胞裂解。相比之下，凋亡（apoptosis）在正常发育的寄生虫感染的肝细胞中被主动抑制（如通过cIAP1），但在寄生虫失效时（如辐射减毒孢子体RAS感染）更易发生。

靶向受感染肝细胞的先天细胞免疫应答

自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞在感染后被招募至肝脏，通过产生IFN-γ等方式限制寄生虫发展。γδ T细胞（gamma-delta T cells）在初次感染中对寄生虫负荷影响有限，但其在招募和激活抗原呈递细胞（APCs），特别是CD11c⁺ 细胞（如树突状细胞DCs）方面至关重要，从而启动针对CD8⁺ T细胞的适应性免疫。APCs通过摄取来自垂死肝细胞的肝期抗原，在肝脏引流淋巴结（LdLNs）或肝脏局部淋巴样结构中，将抗原肽段呈递在主要组织相容性复合物I类（MHC-I）分子上，从而初始活化CD8⁺ T细胞。

靶向受感染肝细胞的适应性免疫

体液免疫（抗体）主要作用于入侵肝细胞前的孢子体。一旦肝期感染建立，细胞介导的适应性免疫成为主要保护机制。

CD4⁺ T细胞不直接杀伤感染肝细胞，但作为辅助细胞，它们对于建立CD8⁺ T细胞记忆应答不可或缺，可能通过“许可”APCs来实现。研究表明，在晚期减毒孢子体疫苗接种者中，多功能记忆CD4⁺ T细胞反应更为显著。

CD8⁺ T细胞是建立无菌免疫（sterile immunity）的关键。初始CD8⁺ T细胞被APCs交叉致敏后，克隆扩增分化为抗原特异性效应CD8⁺ T细胞。这些效应细胞能通过穿孔素/颗粒酶B介导的细胞毒作用以及IFN-γ和TNFα等细胞因子来识别和清除表达MHC-I-寄生虫抗原肽的感染肝细胞。然而，其清除效率相对较低，需要大量细胞才能实现有效保护。

在效应阶段后，一部分CD8⁺ T细胞分化为记忆细胞，包括中央记忆（T_CM）、效应记忆（T_EM）和组织驻留记忆（T_RM）细胞。其中，肝脏CD8⁺ T_RM细胞被认为在提供长期保护中起核心作用。它们驻留在肝血窦，能够快速响应再次感染，在肝期发育的有限时间窗口内清除受感染肝细胞。T_RM细胞的建立需要效应细胞在肝脏中遇到其同源抗原，并在炎症细胞因子（如IL-15）和趋化因子信号存在下分化而来。

肝期抗原

CD8⁺ T细胞识别的前提是肝细胞表面MHC-I分子呈递的肝期抗原肽段。抗原的免疫原性取决于其表达丰度、抗原加工效率（需要蛋白能从PV进入肝细胞质进行蛋白酶体处理、TAP转运和ER加载到MHC-I上）、肽段-MHC-I复合物的稳定性以及特异性T细胞的存在。目前已知仅有少数寄生虫蛋白在正常发育过程中能从PV进入胞质被加工呈递。晚期肝期发育表达的抗原范围更广，可能诱导更广泛、更有效的CD8⁺ T细胞应答，这或许是晚期减毒疫苗策略更优的原因之一。

当前和新出现的恶性疟原虫疫苗接种策略

与不能提供无菌保护的自然获得性免疫不同，疫苗接种旨在诱导更强效、持久的免疫应答。全孢子疫苗是当前研究的重点。

减毒策略

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  辐射减毒孢子体（RAS）：早期发育停滞，在疟疾流行区效果不佳。
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  药物减毒寄生虫（DAPs）：在孢子体感染时使用特定抗疟药（如氯喹），允许肝期完全发育但阻止血期感染。
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  基因减毒寄生虫（GAPs）：通过基因编辑使寄生虫在肝期特定阶段发育停滞。例如，早期停滞的GAP（如Pf△b9/△slarp）与晚期停滞的GAP（如Pf△mei2）。临床试验表明，晚期停滞的GAP（GA2）比早期停滞的GAP（GA1）能诱导更强的保护效力。

这些疫苗，尤其是晚期减毒策略，在试验中显示出与保护相关的免疫特征，如Vδ2⁺ γδ T细胞的扩增、多功能效应记忆CD4⁺ T细胞反应的增强，这些都可能促进保护性CD8⁺ T细胞（尤其是T_RM）的建立。

疟疾暴露的影响

在疟疾流行区，疫苗接种效果往往不如在无疟疾暴露的个体中理想。这可能与 ongoing 血期感染抑制肝期免疫应答的建立、或既往感染导致的CD8⁺ T细胞应答偏向于早期抗原（如皮肤引流淋巴结中呈递的孢子体抗原）有关，从而影响针对肝期抗原的更保护性T细胞库的形成。

concluding remarks and future perspectives

靶向肝期的RTS,S和R21/Matrix-M亚单位疫苗的获批是重要里程碑，但全孢子疫苗，尤其是晚期减毒GAP疫苗，展现出提供更优保护的潜力。未来的挑战包括克服全孢子疫苗的大规模生产和分发难题，提高在流行区的保护效力，并利用高通量组学技术和改进的感染模型进一步揭示肝期宿主-寄生虫相互作用的细节，从而优化疫苗设计。