免疫蛋白酶体通过调节线粒体的功能来调控ILC2细胞的反应

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：The immunoproteasome regulates ILC2 responses by modulating mitochondrial capacity

选择性抑制免疫蛋白酶体（i-20S）β5i亚基可逆转耗竭ATP并抑制ILC2激活，机制涉及诱导ROS破坏TCA循环及氧化磷酸化，在炎症哮喘模型中有效缓解症状。

　　免疫系统中的细胞类型众多，其中先天性淋巴细胞（Innate Lymphoid Cells, ILCs）在维持免疫稳态和应对感染、炎症等过程中扮演着重要角色。ILC2s（Type 2 ILCs）是ILCs的一个亚群，其在过敏性炎症、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）等多种免疫相关疾病中具有显著作用。尽管ILC2s在免疫应答中至关重要，但它们在某些病理状态下也与疾病进展密切相关。因此，理解如何调控ILC2s的功能，尤其是在疾病模型中，成为研究的重点。本文的研究揭示了免疫蛋白酶体（Immunoproteasome, i-20S）在调控ILC2s代谢和功能中的关键作用，并提出了一种通过靶向i-20S实现对ILC2s功能调控的新策略。

### 免疫蛋白酶体与ILC2s功能的关联

免疫蛋白酶体是细胞中一种特殊的蛋白酶复合物，其主要功能是降解被泛素标记的蛋白质，从而维持细胞内蛋白质量的平衡。然而，研究表明，免疫蛋白酶体不仅仅局限于蛋白降解，还参与调控免疫细胞的多种功能，包括抗原处理和呈递。在免疫细胞中，免疫蛋白酶体的催化亚基（β1i、β2i和β5i）取代了构成性蛋白酶体（Constitutive Proteasome, c-20S）的亚基（β1c、β2c和β5c），并且在细胞激活后，免疫蛋白酶体的表达水平显著增加。

在人体ILC2s（hILC2s）中，研究发现其蛋白酶体中约90%的β亚基属于免疫蛋白酶体（β5i），而非构成性蛋白酶体（β5c）。这表明，hILC2s的蛋白酶体主要由免疫蛋白酶体组成，且其在ILC2s的激活过程中具有重要作用。通过使用一种选择性的、非共价、可逆的LMP7（β5i）抑制剂PKS3053，研究发现其对hILC2s的β5i亚基具有极高的抑制活性（IC50为15 nM），而对构成性蛋白酶体的抑制剂WZ1831则效果较弱（IC50约为500倍于PKS3053）。这说明，PKS3053在hILC2s中具有高度选择性，且其作用机制不涉及细胞毒性，反而能够以一种可逆的方式降低ATP水平，从而抑制ILC2s的激活功能。

在体外实验中，PKS3053的处理显著降低了ILC2s对IL-33的反应能力，表现为IL-13和IL-5等关键细胞因子的表达和分泌减少。同时，其对细胞的存活率没有明显影响，进一步支持了其作用机制并非通过直接杀伤细胞，而是通过影响细胞代谢和功能实现的。通过RNA测序分析，研究发现i-20S的抑制对ILC2s的转录组产生了广泛影响，涉及553个基因的表达变化，其中包括与炎症反应和细胞应激相关的基因。这些结果表明，i-20S在调控ILC2s的代谢状态和功能中起着核心作用。

### i-20S通过调控线粒体功能影响ILC2s代谢

线粒体是细胞内重要的能量代谢中心，其功能与细胞的活性密切相关。研究发现，i-20S的抑制导致hILC2s的线粒体功能受损，表现为线粒体质量减少、膜电位降低以及ATP水平下降。这些变化表明，i-20S在维持线粒体代谢过程中具有关键作用。为了进一步验证这一机制，研究使用了其他代谢相关化合物，如α-酮戊二酸（α-KG）进行补充实验。结果显示，α-KG的补充能够显著恢复hILC2s的ATP水平和细胞因子表达，说明α-KG是TCA循环中的关键中间代谢产物，对维持ILC2s的代谢功能至关重要。

此外，研究发现，i-20S的抑制不仅影响了线粒体功能，还导致了细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的积累。ROS是细胞代谢过程中产生的副产物，其水平的升高可能影响多种代谢酶的活性，包括aconitase（ACO2）。aconitase在TCA循环中负责将柠檬酸转化为异柠檬酸，是维持线粒体代谢的重要酶。研究通过酶活性检测发现，i-20S的抑制显著降低了hILC2s中aconitase的活性，而并未影响其表达水平。这一发现表明，i-20S的抑制通过诱导ROS的积累，间接影响了aconitase的活性，从而干扰了TCA循环的正常运作，最终导致ATP水平下降和细胞因子分泌减少。

### 在动物模型中的验证

为了验证i-20S抑制对ILC2s功能的影响是否具有临床意义，研究进一步在小鼠模型中进行了实验。在IL-33诱导的气道炎症模型中，使用了一种对小鼠i-20S具有更强抑制活性的药物IPI-β5-1。结果显示，IPI-β5-1能够有效减少小鼠ILC2s的激活，抑制其在气道中的迁移，并降低IL-13、IL-5等促炎因子的表达水平。这些结果与体外实验一致，进一步支持了i-20S在调控ILC2s功能中的关键作用。

此外，研究还使用了尘螨（House Dust Mites, HDM）诱导的哮喘模型，观察到IPI-β5-1同样能够显著减少气道炎症反应，降低ILC2s和Th2细胞的活化程度，从而减轻哮喘症状。这表明，i-20S的抑制不仅在体外对hILC2s具有调控作用，而且在体内也能够有效干预ILC2s介导的炎症反应。这种调控方式的优势在于其非细胞毒性，意味着该策略可能在治疗慢性炎症性疾病中具有较高的安全性。

### 机制探讨与潜在临床应用

研究进一步探讨了i-20S抑制如何影响ILC2s的代谢通路。通过使用13C标记的葡萄糖进行代谢追踪实验，研究发现i-20S的抑制主要影响了TCA循环的早期步骤，导致柠檬酸水平升高，而α-KG的生成受到抑制。这说明，i-20S的抑制可能通过干扰TCA循环中的关键代谢节点，进而影响线粒体的氧化磷酸化（OXPHOS）功能，导致ATP水平下降，从而抑制ILC2s的激活和功能。

此外，研究还发现，ROS的积累是i-20S抑制导致ILC2s功能下降的重要因素。虽然PKS3053本身并不直接产生ROS，但其诱导的ROS响应信号表明，i-20S的抑制可能通过某种间接机制导致ROS水平升高。这种ROS的积累不仅影响了aconitase的活性，还可能对其他代谢相关酶产生抑制作用，从而进一步干扰细胞的代谢过程。值得注意的是，ROS的积累在某些情况下可能具有双重作用：一方面，它可能抑制免疫细胞的激活功能；另一方面，它也可能触发细胞应激反应，如未折叠蛋白反应（UPR）和缺氧响应，这些反应可能在某些情况下具有保护作用。

然而，这种ROS的诱导机制尚未完全阐明，其具体来源和作用方式仍需进一步研究。此外，研究还发现，IPI-β5-1在体外对其他免疫细胞（如T细胞、单核细胞、树突状细胞等）也具有一定的抑制作用，但对非免疫细胞（如成纤维细胞）则无明显影响。这表明，i-20S的抑制具有高度的细胞选择性，可能为开发新型免疫调节药物提供了重要依据。

### 临床意义与未来方向

目前，哮喘等慢性炎症性疾病的治疗主要依赖于吸入性糖皮质激素，但这些药物可能带来一系列副作用，包括骨质疏松、糖尿病、眼疾和感染风险。因此，寻找新的、更安全的治疗策略具有重要意义。本文的研究表明，通过选择性抑制i-20S，可以有效调控ILC2s的功能，从而减少炎症反应，同时避免细胞毒性。这一发现为开发新型抗炎药物提供了新的思路，特别是在那些对传统治疗反应不佳的疾病中。

此外，研究还指出，ILC2s在某些疾病中的作用可能不仅仅局限于促炎因子的分泌，还可能涉及其他复杂的免疫调节机制。例如，在哮喘中，ILC2s不仅参与早期炎症反应，还可能通过与其他免疫细胞（如Th2细胞）的协同作用维持慢性炎症状态。因此，针对i-20S的抑制策略可能不仅适用于哮喘，还可能对其他由ILC2s驱动的慢性炎症性疾病具有潜在价值。

### 方法学与实验设计

为了验证上述发现，研究采用了多种实验方法。首先，通过Western blot和PCR技术检测了hILC2s中不同蛋白酶体亚基的表达水平，发现β5i在ILC2s中占据主导地位。其次，通过 Seahorse 分析仪评估了线粒体功能，包括基础呼吸、备用呼吸能力、ATP相关呼吸等指标，发现i-20S的抑制显著降低了这些参数。此外，研究还使用了代谢组学和RNA测序技术，全面分析了i-20S抑制对ILC2s代谢通路和基因表达的影响。

在动物实验中，研究采用了IL-33诱导的气道炎症模型和HDM诱导的哮喘模型，分别评估了i-20S抑制对ILC2s迁移、激活和促炎因子分泌的影响。结果显示，IPI-β5-1能够有效减少ILC2s的激活，降低炎症反应，并改善肺部组织的结构。这些结果不仅验证了i-20S在调控ILC2s功能中的作用，还为未来在临床中应用这一策略提供了实验依据。

### 结论与展望

综上所述，本文的研究揭示了免疫蛋白酶体（i-20S）在调控ILC2s功能中的关键作用。i-20S的抑制不仅影响了ILC2s的代谢状态，还通过诱导ROS的积累和aconitase活性的降低，干扰了线粒体功能，从而抑制了ILC2s的激活和促炎因子的分泌。值得注意的是，这种抑制作用是非细胞毒性的，并且具有可逆性，意味着其在治疗炎症性疾病中可能具有较高的安全性和应用潜力。

未来的研究可以进一步探讨i-20S抑制对其他免疫细胞的影响，以及其在不同疾病模型中的具体作用机制。此外，针对i-20S的抑制策略可能还需要优化药物选择性和给药方式，以提高其在临床中的应用效果。总的来说，这一研究为理解免疫细胞代谢调控机制提供了新的视角，并为开发新型抗炎药物提供了重要的理论依据和实验基础。