新型双特异性siRNA策略：单条引导链实现YAP1与WWTR1的高效协同敲低

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：A novel bispecific siRNA concept: Efficient dual knockdown of YAP1 and WWTR1 with a single guide strand

本研究针对Hippo通路关键转录共激活因子YAP（由YAP1编码）和TAZ（由WWTR1编码）因结构特性难以被小分子直接抑制的难题，开发了一种新型双特异性siRNA（bsYW-61）。该分子通过靶向YAP1/WWTR1的保守序列，在多种物种细胞中实现高效协同敲低，显著抑制下游基因表达和癌细胞增殖，且具备良好的安全性和特异性。该策略为肝纤维化、癌症等疾病的治疗提供了新思路，并拓展了双靶向核酸药物的设计范式。

　　

在细胞生长、器官大小调控和疾病发生中，Hippo信号通路扮演着核心角色。该通路的关键效应分子——Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）及其旁系同源物PDZ结合基序的转录共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ）——作为转录共激活因子，虽无DNA结合结构域，但能与TEAD、SMAD等转录因子相互作用，广泛参与细胞增殖、分化和组织修复等过程。然而，YAP/TAZ的异常活化会驱动多种严重疾病，包括肝癌、肝纤维化等。由于YAP和TAZ蛋白缺乏易于靶向的酶活性口袋，且具有结构可塑性和广泛的蛋白质-蛋白质相互作用界面，传统小分子药物难以直接抑制其功能。尽管靶向其共因子TEAD的抑制剂已进入临床试验，但存在肾脏毒性等安全性问题，因此亟需开发直接靶向YAP/TAZ的新策略。

RNA干扰（RNAi）技术为直接抑制YAP/TAZ表达提供了可能。小干扰RNA（siRNA）可通过序列特异性方式降解靶标mRNA，实现基因表达的精准调控。目前，针对多靶点的siRNA策略通常采用混合两种独立siRNA或通过化学连接子构建双靶向siRNA分子，但这些方法存在合成工艺复杂、体内药代动力学不一致等问题。日本电工株式会社（Nitto Denko Corporation）的研究团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》上发表论文，提出了一种新颖的双特异性siRNA设计概念：利用单一siRNA分子的引导链同时靶向YAP1和WWTR1基因的保守序列，从而实现一石二鸟的高效协同敲低。

研究人员为开展本研究，主要采用了以下几项关键技术：首先，通过生物信息学分析筛选YAP1和WWTR1 mRNA的保守区域，并依据5'末端热力学不对称性原则设计双特异性siRNA候选序列；其次，利用体外细胞模型（包括人HepG2细胞、食蟹猴MK.P3(F)细胞、小鼠Hepa1-6细胞和大鼠H-4-II-E细胞）进行高通量筛选和剂量效应评估，通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测基因敲低效率；第三，采用RNA测序（RNA-seq）和荧光素酶报告基因实验系统评估siRNA的脱靶效应和链选择性；第四，通过脂质纳米粒（LNP）和GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联两种递送系统，在小鼠模型中验证双特异性siRNA的体内药效和安全性。

设计靶向YAP1和WWTR1的双特异性siRNA

研究团队首先定义了“共识序列”为在YAP1和WWTR1所有转录变体中连续17个核苷酸至少有13个碱基相同的区域，允许最多4个错配。通过专有算法设计出76条候选siRNA，并在人HepG2细胞中进行初筛。结果显示，28条siRNA在1 nM浓度下对YAP1和WWTR1的敲低效率均超过50%。其中，活性最高的热点区域位于YAP1转录本的第1538–1546位和1657–1667位（以转录变体1为准）。

bsYW-61实现跨物种双靶向敲低

从中优选出的先导分子bsYW-61在不同物种（人、食蟹猴、小鼠、大鼠）的YAP1/WWTR1靶序列上最多仅有2个错配，但其在四种细胞系中均表现出纳摩尔级别的半抑制浓度（IC₅₀），即便对大鼠Yap1（2个错配）仍保持显著敲低活性（IC₅₀ = 382 pM）。这表明bsYW-61具备良好的跨物种反应性，有利于临床前研究的推进。

YAP/TAZ下游基因表达与细胞增殖的协同抑制

为验证双靶向的必要性，研究人员比较了bsYW-61、单靶向siRNA（siYAP1或siWWTR1）以及两者混合使用对HepG2细胞的影响。虽然各处理组对YAP1/WWTR1的敲低程度相近，但只有双靶向处理（bsYW-61或siYAP1+siWWTR1）能显著抑制下游基因CCN1、CCN2和ANKRD1的表达，并有效抑制癌细胞增殖。类似现象在小鼠Hepa1-6细胞中得到重复，证明同时抑制YAP1和WWTR1可协同阻断Hippo通路信号。

bsYW-61的体外安全性评估

在安全性方面，bsYW-61即使在高浓度（300 nM）下也未引起Caspase-3/7活性升高（凋亡指标）或线粒体氧消耗率（OCR）下降，提示其无显著细胞毒性。在人肝细胞（HepaSH）中，bsYW-61亦未影响细胞活力或增加细胞死亡，表明其对正常肝细胞安全性良好。

bsYW-61脱靶活性表征

对bsYW-61进行化学修饰（引入2'-O-甲基/2'-脱氧-2'-氟代核糖、硫代磷酸酯链接等）得到bsYW-61m1后，其靶向活性得以保留，且种子区（seed region）介导的脱靶效应被有效消除。RNA-seq分析发现，bsYW-61仅引起12个潜在脱靶基因的表达变化，其中PSME2和NAPG因与引导链存在2个错配而被确认为杂交依赖性脱靶，但无已知肝毒性关联。荧光素酶报告实验进一步证实bsYW-61具有显著的链选择性，乘客链几乎不引发脱靶效应。

体内双靶向敲低Yap1和Wwtr1

通过LNP（含离子化脂质ALC-0315）递送bsYW-61m1至小鼠体内，单次静脉注射（1 mg/kg）即可在肝脏中实现Yap1和Wwtr1的高效敲低（约80%–90%），效果与混合单靶向siRNA相当，且未引起肝重或转氨酶（AST/ALT）水平异常。采用GalNAc偶联的bsYW-61m3（含5'-乙烯基膦酸酯修饰）进行皮下给药（10 mg/kg），7天后仍能实现70%–80%的基因敲低，凸显其体内稳定性和治疗潜力。

双特异性siRNA策略拓展至CREBBP/EP300靶点

为验证该平台的普适性，研究团队进一步设计了靶向组蛋白乙酰转移酶CREBBP和EP300的双特异性siRNA（bsCE-55）。在HepG2细胞中，bsCE-55可协同降低MYC mRNA和c-Myc蛋白水平，并显著抑制细胞增殖，效果优于单基因敲低。这表明双特异性siRNA策略可广泛应用于具有合成致死效应的旁系同源基因对。

本研究开发的双特异性siRNA技术突破了对YAP/TAZ直接抑制的技术瓶颈，通过单一常规siRNA结构实现双基因协同敲低，简化了生产工艺和体内递送优化流程。bsYW-61在跨物种活性、安全性和特异性方面表现优异，为肝纤维化、肝癌等疾病的治疗提供了新候选分子。该策略不仅深化了对Hippo通路调控机制的理解，而且为靶向旁系同源基因的核酸药物开发树立了新范式，有望推动更多基于RNAi的双靶向疗法进入临床研究。