KlebPhaCol：社区驱动的肺炎克雷伯菌研究资源库揭示新型噬菌体家族Felixviridae

《Nucleic Acids Research》：KlebPhaCol: a community-driven resource for Klebsiella research identified a novel phage family

本研究针对多重耐药肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)治疗困境，构建了包含52个噬菌体和74个菌株的开放资源库KlebPhaCol。研究人员通过表型组学与基因组学分析，发现噬菌体可感染20种序列型(ST)和19种荚膜位点型(KL)，并鉴定出新型噬菌体家族Felixviridae。该资源为研究噬菌体-细菌相互作用提供了标准化平台，对开发针对肠道定植和组织感染的噬菌体疗法具有重要意义。

　　

随着多重耐药肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的全球蔓延，这种被列为"ESKAPE"病原体之一的细菌已成为临床治疗的重大挑战。尤其值得关注的是，该菌株在肠道中的定植能力与炎症性肠病(IBD)等肠道疾病密切相关，使其从单纯的致病菌转变为重要的肠道共生致病菌。传统的抗生素疗法在面对碳青霉烯类(carbapenems)等最后防线抗生素耐药菌株时往往束手无策，这使得噬菌体疗法重新成为研究热点。

然而，噬菌体疗法的临床应用仍面临诸多障碍。其中最关键的问题在于肺炎克雷伯菌具有极高的荚膜多样性——目前已发现超过180种不同的荚膜类型(KL类型)，而依赖荚膜作为受体的噬菌体往往具有较窄的宿主范围。此外，细菌的防御系统和可移动遗传元件进一步限制了噬菌体的有效性。尽管已有多个研究团队报道了针对肺炎克雷伯菌的噬菌体集合，但这些资源分散且缺乏标准化，严重阻碍了噬菌体疗法的系统化发展和机制研究。

为解决这一瓶颈问题，由英国南安普顿大学Franklin L. Nobrega教授领导的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了题为"KlebPhaCol: a community-driven resource for Klebsiella research identified a novel phage family"的研究论文。该研究建立了名为KlebPhaCol的开放资源库，包含52个噬菌体和74个肺炎克雷伯菌分离株，每个都进行了详细的表型和基因组特征分析。

研究人员采用多组学技术手段开展研究，包括噬菌体分离纯化、宿主范围测定、基因组测序与注释、比较基因组学、受体结合蛋白(RBP)结构预测、细菌防御系统分析等。菌株来源涵盖临床分离株和标准菌株，噬菌体则主要从医院废水和生活污水中分离获得。

噬菌体分离与宿主范围分析

研究团队从荷兰乌得勒支医学中心和英国南安普顿的污水样本中分离噬菌体，使用32个具有临床相关性的肺炎克雷伯菌分离株作为宿主。通过富集培养和双层琼脂技术，最终获得52个噬菌体，并根据噬菌斑形态进行纯化。宿主范围测定显示，这些噬菌体能够感染74个测试菌株中的36个(49%)，覆盖20种序列型(ST)、19种荚膜位点型(KL)和7种O抗原类型。

噬菌体基因组特征与分类

基因组分析显示，KlebPhaCol中的噬菌体涵盖7个属，分布在5个已知的肺炎克雷伯菌噬菌体科以及新提出的Nakavirus属和Felixviridae科。值得注意的是，噬菌体RothD无法被归类到任何已知病毒科中，因此研究人员提出了新的Felixviridae科(40-60 kb)和Nakavirus属来容纳这类噬菌体。

非荚膜依赖性噬菌体的优势

研究发现，使用荚膜缺陷菌株分离的23个噬菌体并未表现出比荚膜完整菌株分离的噬菌体更广泛的荚膜趋向性。进一步通过细菌不敏感突变体(BIM)分析发现，Sugarlanvirus、Webervirus、Slopekvirus和Jiaodavirus科的噬菌体使用LPS O抗原、外膜蛋白FhuA或两者作为受体，证实它们不依赖荚膜进行感染。这些噬菌体仍能感染有荚膜的菌株，表明荚膜并不显著干扰它们对表面受体的访问。

受体结合蛋白的结构多样性

研究人员预测了207个受体结合蛋白(RBP)，通过AlphaFold2结构建模和Foldseek聚类，鉴定出14个不同的结构簇。这些预测结构包括长尾丝、短尾丝、尾刺和中央尾丝等。特别值得注意的是，簇12的蛋白质与噬菌体T5的中央尾丝蛋白pb5结构高度相似，已知该蛋白可与FhuA结合。

培养基对噬菌体感染性的影响

在不同培养基( LB vs TSB)中的宿主范围测定显示，培养基组成显著影响噬菌体感染性。在TSB中记录了638次噬菌体感染，而在LB中仅为486次。Jiaodavirus和Slopekvirus在TSB中的成功率更高，分别比LB中高出约1.2倍和1.6倍。

防御系统与噬菌体敏感性的关系

对细菌防御系统的分析显示，测试的菌株中平均编码11±4个防御系统，但防御系统数量与噬菌体敏感性之间无显著相关性。研究人员还在Jiaodavirus和Slopekvirus噬菌体中预测了可能的抗防御基因，包括抗CBASS(cyclic oligonucleotide-based antiphage signaling system)、抗TA(toxin-antitoxin)和抗RM(restriction-modification)蛋白。

肠道相关肺炎克雷伯菌的噬菌体活性

针对与IBD相关的ST323菌株，研究人员评估了噬菌体在好氧和厌氧条件下的活性。液体感染实验显示，尽管厌氧条件下细菌生长受限，但多个噬菌体仍保持活性，表明一些KlebPhaCol噬菌体在肠道相关的低氧条件下仍具有功能活性。

Felixviridae噬菌体的特征与分布

通过基因组分析发现，Felixviridae噬菌体具有一个高度保守的核心区域(gp1-gp24)，主要编码结构蛋白。大多数Felixviridae噬菌体预测为温和型噬菌体，在64,364个完整细菌基因组中的分析显示，所有匹配(n=7,605)均限于肠杆菌科。人类微生物组计划中的89%健康粪便样本中检测到Felixviridae序列，表明其在人类肠道中广泛存在。

研究结论与意义

KlebPhaCol资源库的建立为肺炎克雷伯菌噬菌体研究提供了标准化、开放获取的平台。研究发现非荚膜靶向噬菌体具有更广泛的宿主范围，这为针对不同感染部位的噬菌体疗法选择提供了重要依据。鉴定出的新型噬菌体家族Felixviridae与人类肠道环境密切相关，其生物学特性和生态功能值得进一步研究。

该研究的创新性在于不仅提供了一个实用的研究资源，还深入揭示了噬菌体-宿主相互作用的分子机制。特别是发现培养基条件和氧气可用性显著影响噬菌体效力，提示在实际治疗中需要考虑环境因素进行个性化噬菌体选择。此外，研究证实Felixviridae噬菌体主要以前噬菌体形式存在于肠道中，这对理解噬菌体在肠道微生物组中的生态学作用具有重要意义。

KlebPhaCol的社区驱动模式允许全球研究人员贡献新的分离株和数据，这种协作方式有望加速肺炎克雷伯菌噬菌体研究的发展。随着资源的不断扩展和优化，这一平台将为解决抗菌素耐药性危机提供有力支持，并为理解细菌-噬菌体共进化机制提供新的视角。