通过合成社区进行基准测试，为利用Hi-C邻近性关联技术推断病毒与宿主之间的关系提供了基础数据

《PLOS Biology》：Benchmarking with synthetic communities provides a baseline for virus-host inferences from Hi-C proximity linking

病毒宿主关系推断的Hi-C技术优化与验证。本研究通过合成社区实验和自然土壤样本分析，评估了Hi-C技术在病毒宿主关系推断中的准确性。优化了Z-score过滤方法，确定最低检测限为10^5 PFU/mL，并发现该技术在不同生态系统中具有高特异性（>99%）和中等灵敏度（62%-100%），同时提出标准化方法和应用建议。

　　病毒-宿主相互作用在生态系统的运作中起着关键作用，特别是在微生物群落中。随着研究的深入，科学家们发现病毒在调节微生物活动和进化方面具有重要作用，例如通过改变宿主的代谢活动形成新的“病毒细胞”，诱导裂解从而控制微生物种群动态，以及促进水平基因转移从而影响长期的进化轨迹。然而，大多数环境中的病毒仍然无法与其宿主建立明确的联系，这限制了我们对病毒在生态系统中功能的全面理解。为了解决这一问题，Hi-C（高通量染色体构象捕获）技术被引入，以实验性地推断病毒与宿主之间的相互作用。Hi-C利用邻近连接技术，通过甲醛交联，捕捉物理上共定位的DNA分子，并通过限制性酶切、重连接和高通量测序来分析这些连接，从而揭示病毒-宿主之间的潜在关系。

尽管Hi-C技术在多个研究中被应用，但其准确性尚未得到充分验证。为了评估Hi-C在病毒-宿主链接方面的性能，研究人员设计了一个合成社区（SynCom），其中包括四种海洋细菌菌株和九种具有已知相互作用的噬菌体。他们通过实验确定了噬菌体与宿主之间的吸附效率，并利用这些数据作为基准，以评估Hi-C方法的可靠性。在SynCom实验中，标准的Hi-C样本处理和分析显示，其在标准化接触评分方面的表现不佳，仅达到26%的特异性，但100%的敏感性，且错误匹配可能达到科级水平。然而，通过引入Z值过滤（Z ≥ 0.5），特异性显著提高至99%，尽管敏感性下降至62%。这表明，Z值过滤可以在不牺牲过多真阳性的情况下显著减少假阳性。此外，研究还发现，当噬菌体浓度低于10^5 PFU/mL时，Hi-C方法的可重复性较差，这表明Hi-C方法在低浓度情况下的检测能力有限。

在自然土壤样本中，研究人员进一步应用了优化的生物信息学协议，比较了通过Hi-C邻近连接测序推断出的病毒-宿主链接与基于同源性分析和机器学习的预测结果之间的吻合程度。在应用Z值过滤之前，病毒-宿主链接在门到科的水平上具有较高的一致性（72%），但在属和种的水平上则较低（43%和15%）。Z值过滤虽然在属和种水平上提供了适度的改进（48%和18%），但同时也大幅降低了敏感性，仅有34%的预测被保留下来。尽管如此，Hi-C方法仍然揭示了79个属级一致的病毒-宿主链接，以及293个仅通过Hi-C发现的新链接，这为已经广泛研究的、对气候有重要影响的土壤生态系统提供了许多新的病毒-宿主相互作用的研究方向。

在进一步评估Hi-C方法的检测极限时，研究人员构建了两个新的SynCom，SynCom-2和SynCom-3，其中噬菌体浓度从10^3到10^6 PFU/mL不等，而宿主浓度保持不变。结果表明，只有当噬菌体浓度达到10^6 PFU/mL时，Hi-C方法才能检测到有效的链接，而在更低浓度下，检测效果显著下降。这说明Hi-C方法在实际应用中可能受限于样本中病毒的丰度，特别是在自然环境中，病毒的浓度通常远低于实验室条件下的水平。此外，研究人员还发现，即使在这些较低浓度下，病毒-宿主链接的特异性仍然很高（100%），但敏感性却大幅下降，这进一步强调了Hi-C方法在检测低丰度病毒时的局限性。

在自然土壤样本中，研究人员还评估了Hi-C方法与基于计算的预测工具之间的吻合度。例如，iPHoP和VirMatcher是两种常用的计算工具，它们利用不同的概率模型来整合序列特征，以生成宿主预测分数。在这些工具中，iPHoP的预测能力较强，能够为1,640个病毒操作分类单元（vOTUs）提供高置信度的宿主预测（得分≥90），而VirMatcher则仅能为412个vOTUs提供可靠预测（最终得分≥3）。其中，有12%的iPHoP预测和4%的VirMatcher预测与Hi-C数据一致。然而，当应用Z值过滤后，这些吻合度在属和种的水平上进一步提高，分别为48%和18%。这表明，尽管Hi-C方法在高置信度的预测中表现良好，但在更精细的分类水平上仍存在一定的偏差。

此外，研究人员还发现，Hi-C方法与计算工具之间的差异可能源于数据库的偏差。例如，iPHoP的训练数据主要集中在已知的、研究较为充分的分类单元上，这可能限制了其在预测新分类单元或未充分研究的病毒时的能力。相比之下，Hi-C方法能够捕捉到更广泛的病毒-宿主链接，包括那些在计算工具中未被识别的链接。因此，为了提高Hi-C方法的准确性，建议在应用该方法时，结合计算工具的结果进行综合分析，并在可能的情况下，使用基于SynCom的基准实验来优化过滤参数。

在实际应用中，Hi-C方法的局限性可能包括样本保存条件对结果的影响。例如，在冷冻-解冻过程中，某些细菌菌株的细胞回收率较低，这可能导致Hi-C方法无法准确捕捉到它们与噬菌体之间的相互作用。此外，冻存剂如DMSO、甘油和甜菜碱虽然能够提高细胞回收率，但并未显著改善Hi-C方法的性能。这表明，样本保存条件可能对Hi-C方法的准确性产生影响，尤其是在处理自然样本时。因此，研究建议在实际应用中，尽量使用新鲜样本，并在无法使用新鲜样本时，选择适当的冻存剂以减少对病毒-宿主链接的干扰。

综上所述，Hi-C方法在病毒-宿主链接推断中具有广阔的应用前景，但其准确性和可靠性仍需进一步优化。研究建议在使用Hi-C方法时，结合计算工具的结果进行验证，并根据具体的样本类型和研究目标调整过滤参数。此外，研究人员还提出了一些建议，以支持Hi-C方法的负责任应用，包括建立标准化的生物信息学分析流程、提供透明的局限性讨论以及创建一个集中化的数据库，以促进方法的改进和推广。通过这些努力，Hi-C方法有望成为研究病毒-宿主相互作用的重要工具，从而推动病毒生态学和微生物组科学的发展。