大豆素（Daidzein）和G-1对三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer）中G蛋白偶联雌激素受体1（G-Protein Coupled Estrogen Receptor 1）的激活作用

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：G-Protein Coupled Estrogen Receptor 1 Activation by Daidzein and G-1 in Triple Negative Breast Cancer

乳腺癌防治新策略：GPER1调控机制及大豆异黄酮daidzein的潜在治疗作用

　　乳腺癌在全球范围内被认为是导致死亡的主要原因之一。其中，三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）作为一种侵袭性较强的亚型，其特点是缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）以及人表皮生长因子受体2（HER2）。由于缺乏明确的分子靶点，TNBC对内分泌治疗不敏感，同时对化疗药物也表现出一定的耐药性，这使得其治疗面临较大的挑战。然而，近年来，G蛋白偶联雌激素受体1（GPER1）作为乳腺癌治疗的新靶点逐渐受到关注，特别是在TNBC中。GPER1的激动剂种类繁多，包括天然和合成的物质，如植物来源的异黄酮类化合物——大豆异黄酮（daidzein）。

本研究旨在探讨大豆异黄酮对三阴性乳腺癌细胞中GPER1表达及其下游信号通路（如ERK和AKT）激活的影响。实验中使用了MDA-MB-231乳腺癌细胞，该细胞系是TNBC研究中的常用模型。细胞分别被处理为不同浓度的大豆异黄酮（D）或10 μM的G-1，持续时间为12小时和24小时，并在处理过程中加入GPER1选择性拮抗剂G-36以评估其作用的特异性。通过Western blot技术检测了GPER1的表达水平以及ERK和AKT的磷酸化状态。

研究结果表明，大豆异黄酮能够以剂量和时间依赖的方式上调多种GPER1形式的表达，并促进ERK和AKT的磷酸化。这些效应在加入G-36后被显著抑制，进一步验证了GPER1在其中的特异性作用。与大豆异黄酮类似，G-1同样能够上调GPER1的不同形式的表达，但其对ERK和AKT的磷酸化具有抑制作用。这一发现表明，GPER1的信号传导在不同激动剂的作用下表现出复杂的机制，其功能和表达可能受到多种因素的调控。

GPER1最初于1997年在乳腺癌研究中被发现，通过差异cDNA文库筛选技术，研究者鉴定了在ERα阳性与阴性细胞中表达不同的基因。GPER1基因位于人类染色体7的22号区域，编码一个由375个氨基酸组成的七螺旋跨膜蛋白，属于G蛋白偶联受体（GPCR）的A类。在发现其配体——17β-雌二醇（E2）之后，GPER1被重新命名为G蛋白偶联雌激素受体1，并被广泛认为是一种膜结合的雌激素受体。与传统的核受体不同，GPER1能够快速响应E2，产生非基因组信号，如cAMP和钙离子的释放。这些现象被归类为非基因组、非核的雌激素受体效应，并最终被确认与GPER1相关，包括其对腺苷酸环化酶和PI3K的快速调控，以及对ERK1/2的快速激活、EGFR的转激活和他莫昔芬耐药性的机制。

随着GPER1选择性激动剂（如G-1）和拮抗剂（如G-36和G-15）的合成，研究人员得以更深入地了解GPER1在癌症生物学中的作用。此外，还有其他来源的物质能够激活GPER1，包括真菌来源的霉菌雌激素（mycooestrogens）、合成分子来源的异源雌激素（xenoestrogens）以及植物来源的植物雌激素（phytoestrogens）。植物雌激素作为雌二醇的类似物，具有较强的与雌激素受体结合的能力。大豆异黄酮就是其中的一个典型代表，它来源于大豆，具有与17β-雌二醇相似的结构，属于异黄酮类化合物。它能够结合雌激素受体，并根据浓度和细胞环境的不同，表现出雌激素样或抗雌激素样的作用。

尽管大豆异黄酮在癌症治疗中的潜在作用受到广泛关注，但其对GPER1表达和功能的具体影响仍不明确，尤其是在三阴性乳腺癌模型中，其与GPER1的相互作用尚未得到充分研究。此外，GPER1在细胞内可能以多种形式存在，这些形式可能由翻译后修饰（如糖基化）或可变剪接产生。尽管这些不同形式的GPER1在亚细胞定位、成熟状态和功能活性方面可能存在差异，但目前仍不清楚像大豆异黄酮这样的配体如何调控它们。

在本研究中，我们聚焦于大豆异黄酮对MDA-MB-231细胞中GPER1表达的调控作用。实验中，我们通过不同浓度的大豆异黄酮处理细胞，并在不同时间点检测了GPER1的表达情况。同时，我们使用G-36进行共处理实验，以评估大豆异黄酮对GPER1作用的特异性。研究结果显示，大豆异黄酮能够显著上调GPER1的不同形式的表达，并且这种上调作用与处理浓度和时间呈正相关。同时，大豆异黄酮还能够促进ERK和AKT的磷酸化，这些效应在加入G-36后被明显抑制，表明GPER1在其中发挥了关键作用。

在讨论部分，我们进一步探讨了大豆异黄酮在乳腺癌治疗中的潜力。异黄酮类化合物如Genistein和Daidzein近年来受到越来越多的关注，被认为是开发新型癌症化疗药物的重要候选分子。本研究中，我们选择了MDA-MB-231细胞系，该细胞系是三阴性乳腺癌研究的常用模型，以探究大豆异黄酮在该细胞系中对GPER1表达的影响。实验中，我们使用了25至100 μM的不同浓度的大豆异黄酮处理细胞，并在12小时和24小时的时间点进行检测。结果表明，大豆异黄酮能够以剂量和时间依赖的方式调控GPER1的不同形式的表达，这种调控作用可能为未来针对三阴性乳腺癌的治疗策略提供新的思路。

此外，我们还注意到GPER1在不同细胞环境中的功能可能有所不同。一些研究指出，GPER1在乳腺癌细胞中可能以多种形式存在，这些形式可能具有不同的功能活性。例如，某些形式的GPER1可能更倾向于促进细胞增殖，而另一些形式则可能在抑制细胞生长方面发挥作用。这种功能多样性可能与GPER1的亚细胞定位、翻译后修饰以及与不同配体的相互作用有关。因此，理解大豆异黄酮如何影响这些不同的GPER1形式，对于揭示其在乳腺癌治疗中的具体机制具有重要意义。

在实验方法部分，我们详细描述了细胞培养和处理的具体步骤。MDA-MB-231细胞系被维持在含有L-谷氨酰胺和酚红的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中，其中加入了10%的胎牛血清（FBS）和1%的抗生素-抗真菌溶液（Anti-Anti），以提供必要的营养和防止细菌污染。细胞在完全湿润的培养箱中培养，环境温度保持在37°C，二氧化碳浓度维持在5%。在处理过程中，细胞被接种在T75培养瓶中，以确保实验的可重复性和数据的准确性。随后，细胞被分别处理为不同浓度的大豆异黄酮或G-1，并在指定时间点进行收获，以进行后续的Western blot分析。

在处理过程中，我们特别关注了大豆异黄酮对GPER1表达的影响。通过Western blot检测，我们观察到大豆异黄酮能够显著上调GPER1的不同形式的表达，这些形式可能由不同的翻译后修饰或剪接事件产生。同时，我们还发现大豆异黄酮能够促进ERK和AKT的磷酸化，这表明其可能通过激活这些信号通路来影响细胞的行为。为了验证这一假设，我们加入了G-36，这是一种选择性的GPER1拮抗剂，以评估大豆异黄酮是否特异性地作用于GPER1。结果显示，加入G-36后，大豆异黄酮对GPER1的上调作用以及对ERK和AKT的激活作用均被显著抑制，这进一步证明了GPER1在其中的关键作用。

在研究中，我们还探讨了G-1对GPER1表达的影响。G-1作为一种选择性的GPER1激动剂，被用于验证GPER1在MDA-MB-231细胞中的功能活性。实验结果显示，G-1能够上调GPER1的不同形式的表达，并且这种上调作用与处理时间呈正相关。然而，与大豆异黄酮不同，G-1对ERK和AKT的磷酸化具有抑制作用。这一发现表明，不同类型的激动剂可能通过不同的机制影响GPER1的信号传导。因此，理解这些机制对于开发针对GPER1的靶向治疗策略具有重要意义。

本研究的结论表明，GPER1的信号传导在不同激动剂的作用下表现出复杂的调控机制。大豆异黄酮能够以剂量和时间依赖的方式上调GPER1的不同形式的表达，并促进ERK和AKT的磷酸化，而这些效应在加入G-36后被显著抑制，进一步证明了GPER1在其中的特异性作用。此外，G-1虽然能够上调GPER1的表达，但对ERK和AKT的磷酸化具有抑制作用，这一现象可能与不同激动剂对GPER1的激活方式不同有关。因此，GPER1在乳腺癌中的作用可能不仅限于单一的信号传导路径，而是可能涉及多种复杂的调控机制。

综上所述，本研究为理解大豆异黄酮在乳腺癌治疗中的作用提供了新的视角。通过分析其对GPER1表达和下游信号通路的影响，我们发现大豆异黄酮可能在调控GPER1的多种形式方面具有重要作用，这可能为未来针对三阴性乳腺癌的治疗策略提供新的思路。此外，GPER1在不同激动剂的作用下表现出不同的信号传导特性，这表明其在癌症生物学中的功能可能具有高度的可塑性。因此，进一步研究大豆异黄酮与其他激动剂在GPER1信号传导中的作用，对于揭示其在乳腺癌治疗中的具体机制具有重要意义。

本研究的作者包括Yasmine Mostaphaoui、Rafik Menad、Claire Brun和Elara Moudilou。其中，Elara Moudilou和Rafik Menad在研究的各个方面都做出了重要贡献，包括撰写、验证、监督、资源获取、方法设计、实验实施、资金获取以及概念构建。Yasmine Mostaphaoui则负责撰写原始草稿、可视化、方法设计、实验实施、数据整理以及概念构建。Claire Brun则在资源获取和资金获取方面提供了支持。此外，研究团队还得到了Sacha EHRESMANN、Alexis PERRET和Nassim CHENOUFI等人的技术协助和实验支持，他们的贡献对于本研究的顺利进行至关重要。

在研究过程中，我们特别关注了数据的完整性和可重复性。所有实验数据均在实验完成后进行整理，并在需要时可以向通讯作者申请获取。同时，我们声明不存在可能影响研究结果公正性的利益冲突。这一声明确保了本研究的透明性和可信度，为未来的研究提供了参考。

本研究的成果得益于阿尔及利亚高等教育和科学研究部以及UCLy的UR CONFLUENCE：科学与人文（EA 1598）项目提供的资金支持。这些资金支持使得研究团队能够获得必要的实验设备和试剂，并确保实验的顺利进行。此外，研究团队还得到了来自多个实验室的技术支持，这为实验数据的准确性和可靠性提供了保障。

在当前的研究背景下，乳腺癌的治疗仍面临诸多挑战，尤其是对于三阴性乳腺癌患者而言。由于缺乏明确的分子靶点，传统的内分泌治疗和化疗对TNBC的效果有限。然而，GPER1作为乳腺癌治疗的新靶点，其在TNBC中的表达和功能可能为开发新的治疗策略提供新的方向。因此，进一步研究GPER1在不同激动剂作用下的信号传导机制，以及其在乳腺癌中的具体作用，对于提高乳腺癌的治疗效果具有重要意义。

此外，我们还注意到GPER1在乳腺癌中的作用可能不仅限于单一的信号通路。一些研究表明，GPER1可能参与多种细胞过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭以及对治疗的反应。因此，理解GPER1在不同细胞环境中的功能，以及其与不同配体的相互作用，对于揭示其在乳腺癌中的具体作用机制具有重要意义。这可能为未来针对GPER1的靶向治疗策略提供新的思路。

综上所述，本研究不仅揭示了大豆异黄酮在三阴性乳腺癌细胞中对GPER1表达和下游信号通路的影响，还为理解GPER1在乳腺癌治疗中的作用提供了新的视角。这些发现表明，GPER1的信号传导可能具有高度的可塑性，并且其功能可能受到多种因素的调控。因此，未来的研究应进一步探讨GPER1在不同激动剂作用下的信号传导机制，以及其在乳腺癌中的具体作用，以期为开发新的治疗策略提供理论依据。