《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Structural analysis of 8-anilino-1-naphthalene sulfonate (ANS) binding to the PR-10 allergen Ara h 8
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花生过敏原Ara h 8.0101和8.0201的ANS结合结构及比较研究。通过X射线晶体学解析发现两种异构体均可结合多个ANS分子，结合位点既有疏水核心也有表面非特异性结合，与Bet v 1等PR-10蛋白存在结构同源性但结合模式差异。研究ANS在PDB中的结合模式，揭示其作为荧光探针的普适性及非特异性吸附特性。
安德烈亚·奥马利（Andrea O’Malley）|莱莎·R·奥弗曼（Lesa R. Offermann）|克里蒂·卡特里（Kriti Khatri）|克里斯蒂娜·林恩（Christina Linn）|斯瓦南迪·波特（Swanandi Pote）|简·K·麦克布莱德（Jane K. McBride）|马克恩齐·L·珀杜（Makenzie L. Perdue）|巴里·K·赫尔伯特（Barry K. Hurlburt）|索海拉·J·马莱基（Soheila J. Maleki）|乔治·I·米亚斯（George I. Mias）|马克西米利安·赫鲁兹（Maksymilian Chruszcz）
密歇根州立大学生物化学与分子生物学系，美国密歇根州东兰辛市，邮编48824
摘要
我们之前已经确定了花生过敏原Ara h 8.0101的游离形式结构以及其与模型配体复合物的结构。这些结构展示了PR-10家族成员的多重配体结合能力，并揭示了Ara h 8与主要桦树过敏原Bet v 1之间的结构相似性。在此研究中，我们进一步分析了Ara h 8.0101和Ara h 8.0201与8-氨基-1-萘磺酸盐（ANS）复合物的结构，以及Ara h 8.0201的游离形式。结构研究表明，这两种蛋白质都能结合多个ANS分子。我们还通过荧光实验研究了ANS对Ara h 8.0101和Ara h 8.0201配体结合腔的影响，并将结果与原型蛋白Bet v 1.0101进行了比较。由于ANS常用于基于荧光的配体结合实验，我们分析了PDB数据库中的相关结构数据，并总结了实验确定的ANS结合位点。这些分析表明，ANS不仅有助于研究配体结合位点，还可能参与蛋白质非极性表面的非特异性反应。
引言
与病原体和其他入侵者防御相关的蛋白家族10（PR-10）被认为在植物保护中起作用。PR-10家族也被称为Bet v 1类似家族，这一名称来源于其原型成员Bet v 1（Betula pendula，即桦树）[1]。PR-10家族成员具有高度序列相似性，其结构由三个α螺旋和七个β链组成，形成一个β折叠片（图1A-B），这与人类MLN64蛋白中的START结构域同源[2, 3]。PR-10家族成员既包括主要过敏原也包括次要过敏原，其中Bet v 1是欧洲的主要花粉过敏原之一[4]。
PR-10家族成员的多重配体结合能力已得到广泛研究，研究表明糖基化黄酮类化合物可能是Bet v 1.0101和榛子过敏原Cor a 1.0401的天然配体[5, 6]。PR-10家族成员具有较大的内部结合腔，相对于其整体大小而言，这一结构使其能够同时结合多个配体，这与已报道的Bet v 1.0101和Cor a 1.0401的天然配体大小相符。PR-10家族成员通常能结合脂肪酸、黄酮类化合物、甾体、羟基肉桂酸、芪类化合物、氧脂质、RNA和细胞分裂素等物质，许多PR-10与这些配体复合物的结构已被解析[7, 8, 9, 10, 11, 12]。总体而言，配体结合对蛋白质的整体结构影响不大，但在配体结合状态与游离状态之间会有一些构象变化，尤其是α3螺旋的位置[9, 13]。
花生中的PR-10家族成员Ara h 8有两种异构体（8.0101和8.0201），它们均被确认为过敏原[14]。我们之前已经解析了Ara h 8.0101的结构，并初步探讨了其配体结合能力，发现Ara h 8与Bet v 1具有相似的结构特征[7]。本文介绍了Ara h 8.0201的游离形式结构。正如预期的那样，这两种异构体在结构上与PR-10家族成员一致。
此外，我们还解析了这两种蛋白质与溶剂发色染料8-氨基-1-萘磺酸盐（ANS）复合物的结构。ANS常用于荧光实验中，用于评估蛋白质的疏水腔和初步的配体结合研究[15]。该配体通过两种方式非特异性地与蛋白质结合：一是磺酸基团与蛋白质的阳离子侧链相互作用，二是氨基萘核心占据蛋白质的疏水口袋。在本研究中，Ara h 8.0101和Ara h 8.0201均与ANS共结晶，得到了它们与ANS复合物的结构。实验结果显示，ANS既结合在PR-10家族成员的疏水核心区域，也结合在蛋白质表面。这种结合模式与其他使用ANS的配体结合蛋白结构一致，相关数据可在蛋白质数据库（PDB）中找到[16]。
部分内容摘要
Ara h 8异构体的比较
目前已鉴定出两种花生PR-10家族成员：Ara h 8.0101和Ara h 8.0201[14]。与大多数PR-10家族成员一样，这两种蛋白质的生物学功能尚不清楚。Ara h 8.0101和Ara h 8.0201的序列同一性仅为55%，相似性为75%，对于同属一个过敏原家族的成员来说这一比例较低[17]（图1A）。这两种蛋白质的前19个残基（β链β1）以及残基39-56（对应于β链β2和β3，编号基于Ara h 8.0101）具有高度保守性。
结合位点的相关残基
讨论
Ara h 8属于PR-10家族，是一种次要的花生过敏原，它有两种已登记的异构体：Ara h 8.0101和Ara h 8.0201。尽管它们在结构上相似，但序列同一性较低。与其他PR-10家族成员一样，Ara h 8能够结合多种分子，包括黄酮类化合物、脂肪酸和其他疏水性化合物。虽然该蛋白质的天然配体尚未明确，但参与配体结合的残基已有所研究。
克隆、表达与纯化
Ara h 8.0101的纯化方法如前所述[7]：首先使用三级丁基柱分离蛋白质，随后将其通过连接到?KTA FPLC凝胶过滤系统（GE Healthcare）的Superdex 200柱子进行分离，分离条件为含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl的缓冲液。Ara h 8.0201则通过pET9a-Ara h 8.02表达质粒进行表达，并采用先前描述的纯化方案[1]（但省略了加热步骤），纯化过程中使用了HiPrep Butyl FF（GE Healthcare Life Sciences）柱子进行疏水相互作用分离。
作者贡献声明
安德烈亚·奥马利（Andrea O’Malley）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证及数据分析。马克西米利安·赫鲁兹（Maksymilian Chruszcz）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、项目监督、方法设计、资金申请及数据分析、概念构思。克里蒂·卡特里（Kriti Khatri）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、结果验证及数据分析。莱莎·R·奥弗曼（Lesa R. Offermann）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写。
致谢与资助
本文中的结构数据来源于阿贡国家实验室（Argonne National Laboratory）、东南区域合作访问团队（SER-CAT, 22 BM/ID）以及先进光子源（Advanced Photon Source）的结构生物学中心（SBC, 19 BM）的研究工作。先进光子源的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室的支持，合同编号为DE-AC02-06CH11357和W-31-109-Eng-38。SBC中心的运营资金也得到了相应机构的支持。
