原位解码染色质纳米尺度可塑性：来自原位原子力显微镜成像的洞察

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Decoding chromatin nanoscale plasticity in situ: Insights from native AFM imaging

染色质纳米结构动态组装机制研究。采用原子力显微镜联用低渗处理和高滴落分散技术，首次原位揭示染色质由约10纳米DNA-组蛋白复合体通过动态堆叠形成异质珠链结构，突破传统珠串模型。发现组蛋白乙酰化与ATP调控显著影响染色质柔韧性，为理解染色质功能可塑性提供新模型。

　　

崔洪峰|张宇|陈天宇|郭梦珠|文琪|彭嘉伟|杨一飞|郝显

公共卫生学院与江西省疾病预防与公共卫生重点实验室，江西医学院，南昌大学，南昌，江西330031，中国

摘要

染色质结构及其可塑性是基因调控和DNA相关过程的核心，但其纳米级架构和动态组装机制至今仍不清楚。在这里，我们提出了一种新的原位方法——结合低渗处理和高滴扩散技术——以获得天然的、裸露的染色体，并利用原子力显微镜（AFM）可视化染色质的精细结构。这种策略能够在接近生理条件的情况下进行最小侵入性的观察。我们发现染色质的基本单位是由约10纳米的DNA-组蛋白颗粒组成的。值得注意的是，这些颗粒表现出显著的结构可塑性，通过堆叠和部分熔化动态组装成异质性的核小体珠链。这挑战了传统的“珠链”模型，表明染色质既不均匀也不静态，而是在纳米尺度上具有结构多样性。此外，我们还研究了组蛋白乙酰化和ATP如何调节染色质的可塑性。我们的发现强调了核心颗粒稳定性和时空变异性的共存，为染色质的功能适应性提供了修订的分子框架。这些见解为染色质结构多样性如何支持其复杂的调控能力提供了新的视角。

引言

DNA是主要的遗传物质，在基因转录、细胞分裂和DNA修复等基本生物过程中起着核心作用[[1], [2], [3], [4], [5]]。DNA的可访问性直接影响基因表达和调控机制，这在很大程度上受到染色质结构和动态组织的影响[5,6]。在真核细胞中，染色质由DNA和相关蛋白质的复杂组装构成，其中DNA缠绕在核心组蛋白上形成直径约为11纳米的“珠链”核小体纤维[7]。然而，染色质的精细结构——特别是核小体如何空间组织以构成间期染色质和有丝分裂染色体——仍然不完全清楚[8,9]。

染色质的结构复杂性由多种因素决定，包括核小体动态、核小体间的相互作用以及连接组蛋白或其他染色质相关蛋白质的结合[7,10,11]。其中，组蛋白乙酰化尤为重要。通过中和组蛋白赖氨酸上的正电荷，乙酰化降低了组蛋白与DNA之间的结合亲和力，从而使得染色质结构更加松弛[12]。这种染色质解压缩有助于转录因子和其他转录共激活因子的招募，从而促进基因转录[13]。此外，细胞内的三磷酸腺苷（ATP）水平通过调节组蛋白乙酰转移酶（HAT）的活性进一步影响染色质动态[14]。

尽管染色质在细胞核内的非随机空间排列已被广泛认可，但其组织机制及其对基因功能的影响仍 largely 不清楚[15,16]。历史上，透射电子显微镜研究表明染色质采用30纳米的纤维结构[[17], [18], [19], [20]]。然而，越来越多的证据表明，染色质并不是形成连续、均匀的纤维，而是组装成包含核小体和DNA的复杂的高阶功能结构[[21], [22], [23]]。技术限制仍然阻碍了对染色质精细结构的直接和详细观察原位，阻碍了对其纳米级组织和动态行为的更深入理解[24]。生物技术和成像技术的最新进展使得可视化染色质的精细结构变得越来越可行。例如，O'Shea等人开发了ChromEMT（带有电子显微镜断层扫描的染色质染料）[25]，揭示染色质由直径在5到24纳米之间的灵活颗粒链组成，这些颗粒在间期和有丝分裂染色体中以不同的密度堆叠。此外，Maeshima等人通过冷冻电子显微镜和X射线散射发现，染色质由不规则折叠的10纳米结构组成，而不是均匀的30纳米纤维[[26], [27], [28], [29]]。然而，由于技术要求高和样品制备过程中的损伤等问题，这些技术的应用仍然受到限制[25,[29], [30], [31]]。

在这项研究中，我们采用了原子力显微镜（AFM），结合低渗处理和高滴扩散技术，来原位研究染色质的精细结构及其动态纳米级组装。AFM提供了纳米级的空间分辨率，具有环境适应性，且不需要复杂的样品制备或标记。这使得我们能够在天然的细胞环境中直接观察染色质结构及其动态组装。此外，我们通过药物干预探讨了组蛋白乙酰化和ATP水平对染色质结构的影响，揭示了染色质结构与基因功能之间的相互作用。这项工作旨在为染色质功能的调控及其在细胞生理中的作用提供关键的结构见解。

部分内容

细胞培养

人类结肠癌细胞（HCT116）购自中国科学院细胞库（目录编号：TCHu 99）。细胞在37°C、5% CO₂的培养箱中生长，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的McCoy's 5A培养基进行培养。当细胞融合率达到80–90%时，用胰蛋白酶消化并转移到新的培养皿中。通过光学显微镜观察细胞状态，以确保细胞形态正常且无污染。

细胞处理

为了分离

低渗处理和Triton X-100处理对细胞和核膜的影响

已知高级染色质结构在哺乳动物细胞中是保守的。因此，从HCT116细胞获得的发现通常适用于更广泛的哺乳动物细胞模型[32,33]。为了建立基线，我们首先使用AFM检查未经处理的HCT116细胞。AFM成像显示细胞直径为10–20微米，高度约为2微米；然而，细胞核和内部结构不清晰（图1B）。之前的AFM研究主要集中在有丝分裂期的染色质上，

讨论

在这项研究中，我们使用AFM原位可视化染色质及其精细结构。我们的观察发现，染色质并不是由均匀的纤维网络组成，而是呈现出不均匀的珠状结构。这种结构来源于不规则堆叠的核小体颗粒，每个颗粒的高度约为10纳米，类似于局部聚合物熔体。值得注意的是，未观察到2纳米的DNA双螺旋结构，这可以归因于两个主要因素：

结论

总之，我们的研究揭示了原位染色质结构的固有复杂性，提出了一种新的染色质组织概念模型，并强调了染色质结构与基因调控之间的相互作用。这些见解不仅增强了我们对染色质结构-功能关系的理解，也为探索染色质如何响应细胞信号和环境线索开辟了新的途径。未来的研究可能会进一步阐明染色质结构是如何

CRediT作者贡献声明

崔洪峰：撰写——原始草稿、方法学、实验设计、数据管理、概念化。张宇：方法学、实验设计、数据管理。陈天宇：方法学、实验设计、数据管理。郭梦珠：方法学、实验设计、数据管理。文琪：方法学、数据管理。彭嘉伟：方法学、数据管理。杨一飞：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金获取。郝显：撰写——审稿与编辑、资源协调、项目支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22277047和82160631）、江西省自然科学基金（编号：20252BAC250153）以及江西省卫生健康委员会科技计划项目（编号：202310087）的支持。