2'-脱氧嘌呤底物对非酶促RNA模板指导引物延伸的影响及其在原始遗传系统演化中的意义

《Nucleic Acids Research》：Impact of 2′-deoxyribo-purine substrates on nonenzymatic RNA template-directed primer extension

本研究探讨了2'-脱氧嘌呤核苷酸在非酶促RNA模板复制中的作用。为解决原始遗传物质组成的不确定性，研究人员通过热力学、结构学和动力学分析，发现2'-脱氧嘌呤的掺入虽降低RNA双链稳定性，但可能通过促进链分离平衡复制速率下降的劣势。该工作为理解RNA/DNA混合世界的可行性提供了关键实验依据。

　　

生命的起源一直是科学界探索的核心问题。RNA世界假说认为，RNA曾是早期生命唯一的遗传和功能分子。然而，地球早期的化学环境可能远比我们想象的复杂，除了核糖核苷酸，2'-脱氧核苷酸、阿拉伯核苷酸等也可能并存。近年来，2'-脱氧腺苷（dA）和2'-脱氧肌苷（dI）的模拟前生命合成路径相继被报道，这使得“RNA/DNA世界”假说备受关注——生命或许并非起源于纯粹的RNA，而是从一个RNA与DNA混杂的遗传系统开始演化。这一假说挑战了传统的“遗传物质接管”模型，即DNA后来才取代RNA成为遗传信息载体。如果DNA的构建模块在复杂的酶出现之前就已存在，那么一个关键问题随之而来：在原始RNA中掺入2'-脱氧核苷酸，究竟会促进还是阻碍原始核酸的复制？

为了回答这个问题，由Jack W. Szostak领衔的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了最新成果。他们系统研究了三种2'-脱氧嘌呤（dA, dI, dG）对RNA双链结构、稳定性以及非酶促模板复制化学的影响。这项研究不仅涉及热力学测量和动力学分析，还首次通过X射线晶体学手段，在分子层面揭示了2'-脱氧修饰如何通过改变水合网络来影响双链稳定性。

研究人员主要运用了几项关键技术：通过紫外吸光度变化测量RNA双链的熔解温度（T_m），并利用范特霍夫方程计算热力学参数（ΔH°, ΔS°, ΔG°）；利用X射线晶体学解析了10个含有2'-脱氧嘌呤的16聚体自互补RNA双链结构，分辨率在1.2-2.0 ?之间；通过晶体浸泡法捕获了咪唑鎓桥连的二核苷酸中间体（如GG和dGdG）与RNA引物/模板复合物结合的结构；以及使用带有荧光标记引物的非酶促引物延伸实验，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析产物，并基于米氏方程拟合得到底物的结合常数（K_m）和最大反应速率（k_{obs max}）。

热力学分析结果

研究人员设计了9碱基对的RNA双链，其中中心碱基对可变，两侧为恒定序列，以此评估不同碱基对的热力学性质。研究发现，所有含有2'-脱氧嘌呤的碱基对都比其核糖对应物更不稳定，在25°C下的ΔG°差异约为0.5-1.4 kcal/mol。然而，不同的2'-脱氧嘌呤其 destabilization 的机制不同。dA和dI（尤其是与2-硫代嘧啶配对时，如dA:s²U和dI:s²C）表现出焓罚和熵增，净ΔG°罚约为1.2-1.4 kcal/mol。而dG则表现出焓增和熵罚，净ΔG°罚较小，约为0.5-0.6 kcal/mol。这使得dA:s²U, dI:s²C和dG:s²C在25°C下近乎等能。但在更高温度下，由于dG:s²C的熵罚，其稳定性会低于dI:s²C，这可能对早期复制系统中的链分离有利。此外，研究还发现dG:U摆动错配比G:U更不稳定，而dA:s²U正确配对比s²U:s²U错配的稳定性优势很小（ΔΔG°仅0.6 kcal/mol），这暗示在富含2'-脱氧嘌呤的系统中复制保真度可能面临挑战。

晶体结构研究结果

为了理解稳定性下降的结构基础，研究团队解析了多个含有2'-脱氧嘌呤的RNA双链晶体结构。结果显示，2'-脱氧嘌呤的掺入并未显著改变碱基间的氢键、糖环构象或整体螺旋几何。关键差异在于水合网络。在核糖嘌呤结构中，通常有一个水分子（Water 1）同时与2'-和3'-羟基形成氢键。而在2'-脱氧嘌呤中，由于缺少2'-羟基，Water 1只能与3'-羟基结合，键长变长，位置更灵活，相互作用的稳定性下降。另一个常见的水分子（Water 2）与嘌呤碱基的N3原子结合，在核糖结构中有时还直接与2'-羟基或通过另一个水分子（Water 3）间接相连，形成更稳定的水合壳层。在2'-脱氧嘌呤结构中，这些与2'-羟基相关的相互作用普遍减弱或消失。这种水合作用的减少被认为是双链稳定性下降的主要原因。此外，含有dG:s²C的序列形成了不同的晶格，暗示dG糖环构象可能具有更高的灵活性。

咪唑鎓桥连二核苷酸中间体的结构

通过晶体浸泡实验，研究人员成功观察到了非酶促引物延伸的关键中间体——咪唑鎓桥连的二核苷酸（如GG和dGdG）与RNA模板/引物复合物的结合状态。在GG的结构中，存在一个由三个水分子（A, B, C）形成的、有序且协同的水合网络，稳定中间体结构。而在dGdG的结构中，由于缺少2'-羟基，水分子B的电子密度变弱，水分子C完全缺失，水合网络显著简化。这表明2'-脱氧修饰可能通过影响反应中间体的溶剂化状态来影响其稳定性和反应性。

引物延伸动力学结果

动力学实验评估了2'-脱氧嘌呤作为底物或模板碱基时的复制效率。dIdI底物与II相比，对s²Cs²C模板的结合亲和力下降约2.8倍（K_m增大），但最大反应速率（k_{obs max}）相近。dGdG底物则表现出约1.4倍结合亲和力下降和1.8倍反应速率下降。出乎意料的是，dAdA底物虽然对s²Us²U模板的结合亲和力比A*A提高了2.1倍，但其反应速率却大幅下降了12倍。当2'-脱氧嘌呤位于模板中时，对吡啶底物结合的影响较小。总体而言，用2'-脱氧嘌呤替代核糖嘌呤，并未能显著缩小嘌呤底物和嘧啶底物之间巨大的结合亲和力差异（几十到几百倍）。

研究结论与意义

本研究通过多层次的实验分析，为评估“RNA/DNA世界”假说的可行性提供了关键数据。结果表明，2'-脱氧嘌呤核苷酸可以整合到原始遗传系统中，但会带来一系列的权衡。其积极方面在于，2'-脱氧修饰能降低双链稳定性，这可能有利于复制循环中必需的链分离过程，特别是在虚拟环状基因组复制模式下。同时，DNA骨架的化学稳定性有助于保护长链 oligonucleotide 免受Mg²⁺等二价金属离子催化的裂解反应影响。

然而，挑战也同样存在。2'-脱氧嘌呤的掺入普遍降低了双链热力学稳定性，这主要归因于水合作用的减弱。在动力学上，dI和dG底物表现出结合亲和力下降，而dA底物则遭遇反应速率大幅减缓，且三者均未能缓解嘌呤与嘧啶底物间的固有动力学不平衡。更值得警惕的是，dA与s²U正确配对相对于s²U:s²U错配的稳定性优势微乎其微，这为复制保真度埋下了隐患。此外，2'-脱氧核苷酸可能对功能性RNA（如核酶）的二级结构产生负面影响。

综上所述，这项研究描绘了一幅复杂的图景：一个由核糖核苷酸和2'-脱氧核苷酸混合组成的原始遗传聚合物，其复制过程可能比纯RNA系统稍慢，且保真度面临挑战，但它可能通过更易进行的链分离和交换来获得补偿优势。生命的起源之路可能并非一条从RNA到DNA的简单直线，而是一个充满化学多样性和功能权衡的、更加迂回曲折的过程。未来的研究，例如从混合骨架的核酸库中筛选功能性核酶或连接酶，将对于最终判断这种混合遗传系统的真实潜力至关重要。