多功能荧光双官能交联剂：便捷的合成方法及其在双抗体构建体中的应用，用于特异性识别HER2+癌细胞

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Versatile fluorescent homobifunctional crosslinkers: expedient synthesis and application to di-affibody constructs for specific HER2+ cancer cell recognition

新型荧光连接子设计及AfB二聚体在HER2受体靶向中的应用研究。通过化学合成获得可变长度的荧光连接子L1-L3和L1N，结合含独特半胱氨酸的AfB构建单体和二聚体。实验证明所有构型对HER2表达细胞具有纳米摩尔级结合能力，二聚体与单体结合效率无显著差异。荧光成像和流式细胞术证实连接子长度不影响结合特异性，而半胱氨酸定位影响构象取向。内吞机制研究表明AfB二聚体在细胞摄取过程中保持高结合活性。该研究为肿瘤靶向治疗和分子探针开发提供新工具。

　　近年来，分子生物学领域的进步推动了能够特异性结合生物靶标的人工合成大分子的发展。这类分子不仅能够用于监测或调控靶标的功能，还在多种疾病诊断与治疗策略中发挥着重要作用。其中，抗体及其衍生分子因其对特定靶标的高亲和力和识别能力而被广泛使用。天然抗体的二价特性通过增加表观亲和力（avidity）来增强结合能力，因为每个抗体臂可以同时与相同或相邻的表位结合。受此启发，研究者设计了合成二价分子，以模仿这种增强的结合能力，并引入异二价识别的可能性，即每个配体可以结合不同的蛋白质或同一蛋白质的不同区域。

尽管已有多种平台和结合物被开发用于增强结合能力并引发细胞反应，但基于完整抗体的构建物仍然较大，其复杂的结构限制了工程改造的范围以及可结合的识别模体数量。因此，研究者开始关注更小的结合模体，如单域抗体片段（nanobodies）或非免疫球蛋白亲和蛋白——affibodies（AfB）。这些分子来源于金黄色葡萄球菌蛋白A的结构化三螺旋束结构，通过随机突变暴露在表面的两个相邻螺旋转基因的氨基酸残基，而不会影响其整体三维结构。AfB具有出色的生物物理特性，其结合表面积与抗体Fab区域的结合表面积相当，因此在针对多种生物靶标的亲和结合方面有广泛应用。

为了进一步提升免疫治疗策略，研究者对传统二价抗体的兴趣逐渐转向二价或更广泛的多价AfB构建物，这些构建物能够同时结合多个表位。通常，这些多价AfB通过重组克隆方法制备，由多个AfB模体通过柔性肽链连接而成，例如(G?S)?或(S?G)?。然而，尽管重组多价AfB显示出良好的应用前景，其结合位点可能因连接链的邻近性而受到阻碍。此外，多价构建物也可以作为具有多个连接位点的纳米颗粒，从而实现更复杂的靶向功能。

除了抗体-药物偶联物（ADCs）之外，AfB通常与不同载体进行偶联，以实现治疗和/或成像目的，例如放射性金属离子、荧光探针等。这种偶联可以通过非特异性靶向适合的氨基酸残基（如半胱氨酸、赖氨酸）或通过特异性生物偶联或标记（如硫醇定向偶联、叠氮-炔烃偶联、His标签等）来实现。其中，最常用的硫醇选择性试剂是马来酰亚胺基团（MI），它是一种良好的亲电子试剂，能够快速与硫醇基团结合。这种特异性偶联方式虽然优雅，但需要肽序列中存在一个独特的半胱氨酸模体。幸运的是，半胱氨酸可以在AfB的合成过程中引入，尤其是通过提到的固相肽合成（SPPS）方法。

本研究报道了一种新型的内在荧光同双功能连接物（L1–L3，L1N）的合成与表征。这些连接物可用于特异性识别模体的共价组装，例如AfB。荧光探针在生物医学研究中具有重要价值，不仅能够用于监测靶标的生物分布（如荧光显微镜），还能用于通过光学转导器确定结合亲和力（KD）。本研究采用了一种适用于水性环境的二甲氧基喹吖啶inium（DMQA）荧光探针，该探针可以从商业可得的前体中以相对较低的成本合成。此外，其发射波长约为654 nm，不受pH影响，并且与常见的仪器协议（如流式细胞术）兼容。由于连接物长度和柔韧性等结构参数可能影响结合效率，因此在本研究中，将该荧光探针与不同长度的柔性聚乙二醇（PEG）链结合，以优化最终组装物的结合能力。

为了验证荧光连接物的实际应用价值，我们制备了针对HER2受体的特异性单价和双价AfB构建物。这些构建物的主要特点包括（i）AfB骨架的可控取向，（ii）连接到荧光探针的PEG链长度可调。在选择AfB时，我们采用了Feldwisch等人描述的优化AfB ZHER2:2891，因为该AfB与抗原HER2结合的KD值为76 pM，这是通过表面等离子共振（SPR，Biacore）测定得出的。最近，Novak等人再次验证了该AfB的高亲和力，其KD值为90 pM。此外，还合成了一种双突变AfB，该AfB在M9Nle和D37E两个位置进行了额外替换，表现出增强的亲和力，其解离常数为KD = 33 pM。在本研究中，该AfB序列被补充了独特的N端（Nter）或C端（Cter）半胱氨酸（Cys），使其能够通过连接物（L1–L3，L1N）进行特异性偶联，从而获得单价和双价AfB构建物。Cys修饰的AfB版本的HER2结合亲和力预计与双突变AfB保持一致。

为了进一步评估这些构建物的性能，我们制备了单价AfB-L1和AfB-L1N作为单价参考构建物，而双价AfB则通过连接两个相同的AfB来获得，使用双功能连接物L2或L3，从而形成相对于荧光探针对称的构建物（AfB2-L2和AfB2-L3）。这些构建物的荧光标记使得我们能够通过流式细胞术和显微镜技术对它们与癌细胞表面的结合能力进行体外验证。我们讨论了双价AfB2-L2和AfB2-L3构建物的结合效率，并将其与单价构建物进行比较。同时，我们还探讨了AfB偶联取向（在C端或N端连接Cys）对构建物结合亲和力的影响。最后，我们研究并量化了这些构建物在与HER2高表达的癌细胞模型孵育后的内化过程，采用了一种新的基于胰蛋白酶的实验方法。

本研究的核心创新点在于，通过将一种灵活的荧光平台与可变长度的双功能PEG连接物结合，实现了新的多功能构建物的设计。这种结合方式不仅能够提高构建物的结合能力，还能够增强其在细胞内的监测能力。此外，通过引入独特的半胱氨酸模体，使得构建物能够通过特异性偶联方式获得更复杂的结构，从而在癌症免疫治疗中发挥更大作用。本研究的结果表明，这种新型的合成方法为监测分子治疗药物在细胞内的行为提供了新的可能性，并为设计具有可调节多价性的构建物提供了更灵活的选择。这种策略的潜在应用包括更精准的靶向治疗、更高效的药物递送系统以及更深入的生物成像研究。

在实验过程中，我们首先对荧光探针和连接物的合成方法进行了优化。通过连续的环化反应，在存在1,3-二氨基丙烷（DAP）的情况下，可以引入一个或两个氨基到芳香族荧光骨架上（前体2和3，图1A）。为了获得化合物2，第二个环化反应使用了3-氨基丙醇，这种方法通过氨基完成环化，但引入了一个初级醇基团。随后，我们通过硫醇定向偶联的方式将这些前体与AfB进行偶联，以制备所需的构建物。这一过程的关键在于确保连接物与AfB之间的偶联效率，以及维持构建物的结构完整性。为了进一步验证构建物的性能，我们使用了流式细胞术和显微镜技术，对它们与HER2表达的SKOV3细胞的结合能力进行了评估。结果表明，所有测试的构建物均能特异性地结合到SKOV3细胞表面的HER2受体上，并表现出纳米摩尔级别的亲和力。

此外，我们还研究了构建物在细胞内的内化机制。通过胰蛋白酶处理，我们测量了构建物在细胞内的荧光信号，从而确定其内化过程。这种内化机制对于评估构建物在体内的行为具有重要意义，尤其是在癌症治疗中，能够更准确地了解药物如何被细胞吸收并发挥作用。通过这种实验方法，我们发现不同构建物的内化效率存在差异，这可能与其结构特性有关。例如，单价构建物和双价构建物在细胞内的分布和内化时间可能有所不同，这进一步说明了构建物设计的重要性。

在本研究中，我们还探讨了不同连接物对构建物性能的影响。通过比较不同长度的PEG连接物对构建物结合能力的影响，我们发现较长的连接物可能有助于提高构建物的灵活性，从而增强其与靶标的结合效率。此外，我们还研究了连接物的结构对构建物在细胞内的分布和行为的影响。例如，某些连接物可能在细胞内形成更稳定的构型，从而提高其在细胞内的保留时间。这些发现对于进一步优化构建物的设计具有重要意义，也为未来的癌症免疫治疗研究提供了新的思路。

通过这些研究，我们不仅验证了新型荧光连接物在癌症治疗中的应用潜力，还展示了其在生物成像和药物递送中的优势。这些构建物能够更精准地识别靶标，并在细胞内实现有效的内化，从而提高治疗效果。此外，通过引入不同的连接物和修饰方式，我们能够设计出具有不同功能特性的构建物，以满足不同治疗需求。这些研究结果表明，这种新型的合成方法在生物医学研究中具有广泛的应用前景，并为未来的药物开发和治疗策略提供了新的可能性。

总之，本研究通过设计和合成新型的内在荧光同双功能连接物，为癌症免疫治疗提供了新的工具和方法。这些连接物不仅能够提高构建物的结合能力，还能增强其在细胞内的监测能力，从而为治疗效果的评估和优化提供了重要支持。此外，通过引入不同的修饰方式和连接物，我们能够设计出具有不同功能特性的构建物，以满足不同治疗需求。这些研究结果表明，这种新型的合成方法在生物医学研究中具有广泛的应用前景，并为未来的药物开发和治疗策略提供了新的可能性。