自燃型NO供体-aurovertin B结合物的合成作为强效的抗三阴性乳腺癌药物

《Bioorganic Chemistry》：Synthesis of self-immolative NO donor-aurovertin B conjugate as potent anti-triple negative breast cancer agents

三阴性乳腺癌是一种高度侵袭且预后不良的乳腺癌亚型，现有疗法效果有限。研究将天然产物奥沃维汀B（AurB）与硝普钠供体通过自分解二硫键连接，形成AurB-S-S-NOD衍生物。在肿瘤微环境的高谷胱甘肽水平下，二硫键选择性断裂触发自分解，可控释放AurB和NO供体，协同抑制肿瘤细胞增殖并诱导铁死亡。化合物7g的体外半数抑制浓度分别为1.41和3.10 μM，体内实验显示其抑制肿瘤生长率达43.5%。该策略通过靶向递送和红ox反应实现高效低毒抗肿瘤治疗。

　　

陈一丽|周迅|叶婷珠|彭媛|詹扎军|罗芳|马立峰

教育部绿色制药技术及相关设备重点实验室，浙江工业大学药学院，中国杭州310014

摘要

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型，预后较差，对现有疗法的反应有限，对全球女性健康构成了严重威胁。Aurovertin B（AurB）是一种源自微生物的ATP合成酶抑制剂，已被证明能选择性地抑制TNBC的增殖和转移，成为一种有前景的先导化合物。然而，由于其高毒性，其治疗潜力受到了限制。为了降低毒性并增强抗肿瘤效果，AurB与NO供体结合，通过基于二硫键的自燃连接器合成了多种AurB-S-S-NOD衍生物。这些连接器在肿瘤细胞的还原环境中可被选择性切割，因为细胞内的谷胱甘肽水平较高。这种切割会引发自燃过程，最终实现AurB的控释。体外研究表明，这些衍生物的抗TNBC活性与其快速释放AurB密切相关，其中7g衍生物表现出最快的释放速率，在MDA-MB-231细胞中的IC₅₀值为1.41 μM，在4T1细胞中为3.10 μM。机制研究表明，7g通过抑制GPX4活性诱导铁死亡（ferroptosis），从而导致肿瘤细胞死亡。在BALB/c小鼠皮下模型中，腹腔注射7g（10 mg/kg）显著抑制了肿瘤生长，肿瘤生长抑制率为43.5%。这些结果表明7g是一种有前景的TNBC治疗候选药物，可能通过诱导铁死亡发挥作用。

引言

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种缺乏雌激素受体（ER）、孕酮受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达的亚型，具有高度侵袭性且预后较差[1]。传统的乳腺癌治疗方法对TNBC效果不佳[[2], [3], [4]]。Aurovertins是一类从真菌次级代谢物中提取的高还原性聚酮类化合物，具有独特的2,6-二氧杂二环[3.2.1]辛烷核心结构[[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]]。先前的研究显示，Aurovertin B（AurB）作为一种ATP酶抑制剂，通过结合F1-ATPase的β亚基来抑制线粒体氧化磷酸化[12,13]。它对TNBC增殖和转移的选择性抑制作用引起了广泛的研究兴趣[14,15]。然而，AurB的固有缺陷（如水溶性差、剂量依赖性毒性和治疗窗口窄）阻碍了其作为候选药物的应用[7]。因此，需要对AurB进行结构修饰以提高其成药性。

双药设计是一种有效的优化策略，可以增强药物活性并减少副作用[16,17]。该方法通过共价连接器将两个药效团连接起来[16,18]。通常考虑两种主要设计理念：体内切割双药前体以释放原始药物分子，或者保留完整的结合物，使整个分子发挥药理作用。NO是一种重要的内源性信号分子，参与调节多种生理和病理过程[19]，高水平的NO可以通过多种机制诱导肿瘤细胞死亡[20]。NO供体是一类在生理条件下释放一氧化氮（NO）的前体药物，在治疗剂开发中得到了广泛应用[21]。迄今为止，已经设计并合成了多种NO供体-AurB衍生物，以提高AurB的抗肿瘤活性和成药性。在我们之前的研究中，合成了结合苯磺酰呋喃oxan NO供体和AurB的双药前体，并证明了它们能诱导铁死亡[22]。然而，这些衍生物的靶向能力不足，且AurB的固有药理活性也受到了一定程度的影响。

自燃是一种选择性的释放模式，其特征是在受到特定刺激时能够迅速激活[23]。它通常由一个保护基团、一个功能基团（通常是药物分子）和一个自燃连接器（SIL）组成[24]。SIL在暴露于特定外部刺激时化学不稳定，其键会断裂并触发级联反应，最终释放功能基团[25]。最近的进展扩展了用于控制药物释放、前体药物激活和刺激响应纳米材料的自燃系统[[26], [27], [28]]。其中，二硫键自燃连接器（DSILs）是一类在血液中稳定但在富含谷胱甘肽（GSH）的肿瘤微环境中快速断裂的SILs，确保了肿瘤中的选择性药物释放[[29], [30], [31]]。在本研究中，通过可生物切割和可释放药物的DSILs将双药前体连接起来，旨在克服上述结合物的缺点，并通过自燃氧化还原反应实现体内药物释放。

分子对接分析（图1A）揭示了AurB与ATP酶的结合模式，其中AurB的7-OH位置通过与周围氨基酸残基的紧密相互作用起着关键作用。随后，在AurB的7-OH位置引入了可生物切割的DSIL作为侧链。然后，通过酯化将不同类型的苯磺酰呋喃oxan NO供体连接到DSIL上，合成了三系列AurB-S-S-NOD衍生物（6a-8g）。接下来，在体外筛选了这些化合物的抗TNBC活性，并分析了AurB释放速率与其细胞毒性效应之间的相关性。作为最有前景的衍生物，7g在体内皮下肿瘤模型中进行了评估。

部分内容

NO供体和AurB-S-S-NOD衍生物的合成

为了开发一种新型的TNBC治疗药物，将AurB与NO供体（AurB-S-S-NOD）结合，并将DSILs引入双药前体的设计中。根据预测的对接模式（图1A），目标结合物可以通过片段1、片段2和DSILS构建（图1B）。在本研究中，选择了苯磺酰呋喃oxan NO供体作为片段1。据报道，二酰呋喃oxan NO供体可以作为掩蔽的腈氧化物亲电试剂来靶向GPX4

结论

本研究成功设计并合成了一系列AurB-S-S-NOD衍生物，利用可切割的二硫键将天然产物AurB与NO供体连接起来。这种策略旨在同时提高AurB的安全性和抗TNBC效果。体外实验证实，这些衍生物在二硫键断裂时会发生自燃，有效释放活性AurB。相对较快的释放速率是一个关键因素

化学方法

所有试剂和溶剂均从商业供应商处购买，无需进一步纯化即可使用。所有反应均通过硅胶板GF254（青岛海阳化工，中国）进行TLC分析，并在紫外光（254 nm或365 nm）下观察。柱层析（硅胶，200–300目，青岛海阳化工，中国）用于纯化所有目标化合物。NMR谱在Bruker AV-400光谱仪上记录，使用四甲基硅烷作为内标

CRediT作者贡献声明

陈一丽：撰写——原始草稿，研究，数据分析。周迅：研究。叶婷珠：数据管理。彭媛：研究，数据管理。詹扎军：方法学，资金获取，概念设计。罗芳：资源，方法学。马立峰：撰写——审稿与编辑，监督，方法学。

利益冲突声明

所有作者声明没有可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82273825）的财政支持