一种基于苯并噻唑的近红外荧光探针，用于选择性激活检测CORM-3

《Bioorganic Chemistry》：A benzothiazole-based near-infrared fluorescent probe for selective turn-on detection of CORM-3

CORM-3检测的新型近红外荧光探针开发及性能研究，解决现有探针依赖金属离子、无法区分CORM-3与CO、水溶性差及检测条件不明确等问题，实现0-266.6 μM范围内高灵敏度（LOD=0.034 μM）选择性检测，并通过活细胞成像验证应用潜力。

　　

杨俊杰|周春玲|严立强|邹建梅

桂林理工大学化学与生物工程学院，中国桂林541006

摘要

三羰基氯(甘氨酸)钌(II)（CORM-3）是一种可溶于水的二氧化碳（CO）释放分子，通过调节炎症反应、在创伤性脑损伤中提供神经保护、通过调节细胞内pH值实现心脏保护以及改善代谢和肠道功能障碍，展现了多方面的治疗潜力。然而，在生物系统中准确检测CORM-3仍然具有挑战性，因为现有的荧光探针通常需要外源性金属离子，对CORM-3的特异性较差，或者检测条件不够理想。为了解决这些问题，我们开发了一种基于苯并噻唑的近红外（NIR）荧光探针，能够选择性地响应CORM-3。该探针具有高灵敏度（LOD = 0.034 μM）和良好的定量相关性（0–266.6 μM），并且对CO的干扰具有很强的抵抗力。缓冲液的组成显著影响检测性能，因为基于磷酸盐的缓冲液会抑制荧光，因此需要仔细选择溶剂。这种探针能够在活细胞中成功可视化CORM-3，为探索其药理机制和治疗应用提供了潜在的方法。这些发现推进了CORM-3的检测方法，并支持其临床转化，以管理与CORM相关的病理生理过程。

引言

三羰基氯(甘氨酸)钌(II)的分子式为[Ru(CO)?Cl(glycinate)]，通常简称为CORM-3。这种化合物具有优异的水溶性，并具有一系列独特的生理效应，使其在治疗各种疾病方面具有价值。例如，CORM-3可以同时减少促炎细胞因子并增加抗炎细胞因子，从而发挥抗炎作用，有助于管理急性器官衰竭[1,2]。此外，CORM-3已被证明可以通过缓解神经元凋亡和情绪障碍提供神经保护和治疗益处，有助于改善创伤性脑损伤[[3], [4], [5]]。它还通过调节细胞内pH值和在再氧合过程中抑制碳酸氢盐转运蛋白，在心脏功能中起保护作用[6]。此外，CORM-3显著抑制由脂多糖和高葡萄糖水平诱导的炎症细胞因子的表达，使其成为治疗糖尿病相关牙周炎的有希望的候选药物[7,8]。研究还表明其在改善肠道屏障功能障碍方面具有潜力，暗示了其在治疗出血性休克后肠道损伤中的未来应用[9]。作为一种有效的二氧化碳（CO）供体，CORM-3通过可控的CO释放调节各种生理过程，表现出血管扩张和降压特性[10,11]。此外，新兴证据表明，CORM-3可能通过抑制谷氨酸合成和靶向细菌细胞内三羧酸（TCA）循环所需的铁-硫酶而发挥潜在的抗菌作用。这种干扰导致谷氨酸缺乏，并同时影响氮代谢和TCA循环活性[12]。因此，检测CORM-3对于推进相关疾病的治疗和阐明其潜在的生理功能具有重要意义。

荧光探针技术在CORM-3的检测中表现出显著的性能，具有高灵敏度、良好的选择性、出色的原位分析和可视化成像能力，因此受到了广泛关注[[13], [14], [15]]。已经开发了多种荧光探针，能够有效检测CORM-3（表S1）。然而，这类探针的开发仍然不足，仍有几个挑战尚未解决。首先，某些探针需要特定金属离子的存在（例如Pd²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺），这可能限制了它们在生物系统中的应用[[16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23]]。其次，许多探针无法有效区分CORM-3和CO，使得难以确定信号是来自CORM-3还是CO[[24], [25], [26]]。第三，荧光探针实现足够水溶性的挑战尚未得到有效解决[27]。第四，探针的检测条件尚未得到充分研究，包括溶剂选择和缓冲液的影响等关键因素。

为了解决这些挑战，我们开发了一种基于2-(2-羟基苯基)苯并噻唑荧光团的近红外荧光探针（方案1）。该荧光团包含一个质子供体（-OH）和一个相邻的质子受体（-N=），这促进了激发态分子内质子转移（ESIPT），导致较大的斯托克斯位移和强烈的发光特性[[28], [29], [30], [31]]。硝基芳香族基团作为与CORM-3相互作用的识别位点[[32], [33], [34], [35]]。此外，1-(2-吗啉基乙基)吡啶离子基团提高了探针的水溶性。因此，该探针在水介质中选择性地与CORM-3反应，产生显著的近红外荧光信号，并且不受CO存在的影响。该探针能够在0到266.6 μM的线性范围内定量检测CORM-3，相应的检测限低至0.034 μM，从而能够在溶液和活细胞中有效检测CORM-3。重要的是，缓冲系统对CORM-3的检测有显著影响，因为磷酸盐缓冲液（PB）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）会严重抑制探针的荧光信号。

材料

所有使用的试剂均为分析纯（AR），无需进一步处理。

探针的合成

中间体1和2按照已建立的文献方法[36,37]制备。随后，化合物1（0.20 g，0.50 mmol）和化合物2（0.16 g，0.56 mmol）在无水乙醇（15 mL）中回流20小时。然后蒸发溶剂，所得固体使用硅胶柱进行纯化。选择二氯甲烷/甲醇（20:1，v/v）作为洗脱系统，

探针与CORM-3的激发和发射光谱

在DMSO/HEPES（1:1，v/v，pH = 7.4）混合溶液中，探针（10 μM）与CORM-3（445 μM）反应后，荧光激发光谱在415 nm处显示一个峰值（图1）。因此，所有后续的荧光发射光谱测量都使用415 nm作为激发波长。所得的荧光发射光谱在665 nm处显示一个峰值，斯托克斯位移为250 nm，表明该探针可以通过近红外光谱检测CORM-3

结论

CORM-3展现出多种生理效应，包括抗炎调节、神经保护、心脏保护以及代谢紊乱的管理。然而，CORM-3的临床转化和机制研究受到当前检测方法的限制。为了解决这些挑战，我们开发了一种基于2-(2-羟基苯基)苯并噻唑骨架的新型NIR荧光探针。该探针包含一个硝基芳香族识别基团

CRediT作者贡献声明

杨俊杰：撰写——原始草稿，可视化，正式分析，数据管理。周春玲：研究，正式分析，数据管理。严立强：撰写——审稿与编辑，可视化，资源获取，正式分析，概念化。邹建梅：资源获取，研究，资金获取，正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22364010和22264011）的资助。