RNA变性在环状RNA分离中的关键作用及机制研究

《Nucleic Acids Research》：RNA denaturation underlies circular RNA separation

本研究针对环状RNA（circRNA）与线性副产物分离不足的瓶颈问题，系统评估了凝胶电泳和高效液相色谱-尺寸排阻色谱（HPLC-SEC）对不同合成策略circRNA的分离效果。研究发现RNA变性是成功分离circRNA的关键因素，并揭示镁离子对HPLC-SEC分离的干扰机制。在优化变性条件下，HPLC-SEC可直接从粗酶反应中纯化circRNA，为circRNA therapeutics的规模化生产提供了重要技术支撑。

　　

在mRNA疫苗成功应对COVID-19疫情后，环状RNA（circRNA）作为一种新型核酸治疗 modality 引起了广泛关注。与线性mRNA相比，circRNA具有共价闭合的环状结构，没有游离末端，因此能抵抗核酸外切酶介导的降解，表现出更高的稳定性。这种增强的稳定性使circRNA成为长效蛋白质表达的理想模板，其治疗潜力还体现在microRNA海绵、蛋白质隔离和基因编辑等领域。此外，经过严格纯化的未修饰circRNA能够逃避免疫监视，显示出更低的免疫原性。

然而，体外合成circRNA的生产过程面临重大挑战。从线性RNA前体合成到环化反应，再到纯化和质量控制，每个环节都存在技术瓶颈。其中，最关键的难点在于circRNA与线性RNA副产物的分离效率不足。由于circRNA与线性RNA在物理化学性质上高度相似，传统分离方法往往难以获得高纯度产品，这直接影响了circRNA治疗剂的可靠性和可重复性。

为了攻克这一技术难题，来自奥胡斯大学的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了最新研究成果。研究人员系统性地比较了凝胶电泳和HPLC-SEC对circRNA的分离效果，重点探究了RNA变性在分离过程中的作用机制。研究团队设计了五种不同的circRNA构建体，涵盖了T4 RNA连接酶2（T4lig2）、permuted intron-exon（PIE）和self-targeting splicing（STS）三种主要的环化策略，从而全面评估不同合成方法对后续纯化分析的影响。

在研究方法上，团队运用了多种关键技术：通过体外转录合成线性RNA前体，采用T4 RNA连接酶2和核酶（ribozyme）催化进行环化反应；利用RNase R消化和RNase H切割实验验证环化效率；比较了琼脂糖凝胶电泳（AGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和毛细管凝胶电泳（CGE）在不同变性条件下的分离效果；系统优化了HPLC-SEC的分离条件，包括柱温、pH值、盐浓度等参数；通过AMT（4'-amino-methyl trioxsalen hydrochloride）交联实验研究RNA结构对分离的影响。

凝胶电泳分析揭示变性条件的关键作用

研究发现，在天然条件下，circRNA与线性RNA的分离效果普遍不佳。自制的1%琼脂糖凝胶完全无法区分大小相同的circRNA和线性RNA，而2%琼脂糖凝胶虽然能观察到circRNA迁移稍快，但分辨率十分有限。相比之下，商业预制的E-Gel系统在特定电泳程序下能实现有效分离，值得注意的是，达到80°C以上的凝胶温度对分离效果至关重要。

在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，变性条件对分离效果的影响更为明显。天然PAGE在4°C条件下，circRNA迁移速度略快于线性形式，但分离效果不理想，特别是核酶合成的circRNA出现明显的拖尾现象。当在室温下进行电泳或对样品进行预变性处理（47.5%甲酰胺和快速冷却）后，分离效果显著改善。在7.5 M尿素变性PAGE中，circRNA迁移明显变慢，条带更加清晰，分离效率最高。

毛细管凝胶电泳的结果进一步验证了变性处理的重要性。在天然条件下，CGE无法区分T4lig2-CVB3-GFP和T4lig2-origami circRNA与其线性前体，而预变性处理不仅使circRNA迁移更快，还显著提高了条带的锐度，表明变性处理能增加RNA构象的均一性。

柱温优化实现HPLC-SEC高效分离

基于凝胶电泳的发现，研究人员将注意力转向HPLC-SEC的优化。通过改进柱加热系统，确保流动相在进入色谱柱前充分预热，团队系统评估了温度对分离效果的影响。

使用SEC-2000柱（2000 ?孔径，5 μm粒径）分离T4lig2-CVB3-GFP产物时，30°C条件下circRNA峰与前体峰严重重叠。将柱温升至45°C或60°C后，分离分辨率显著提高，线性RNA的保留时间缩短更为明显。SEC-1000柱虽然也受温度影响，但分离效果始终不如SEC-2000。

对于更复杂的PIE和STS系统，升温同样改善了分离效果，但STS△P10-CVB3-GFP构建体在60°C时出现circRNA与线性峰的较大重叠。值得注意的是，SEC-4000柱（4000 ?孔径）在30°C和65°C下均无法区分circRNA与前体和小内含子，表明孔径选择对分离效果至关重要。

流动相条件对分离的影响

系统评估不同pH值和盐浓度的Tris-EDTA缓冲液发现，pH值对分离效果有显著影响。对于T4lig2-CVB3-GFP构建体，pH从7.5降至5.5时分离分辨率下降，但进一步降至4.1时分辨率反而提高。类似趋势也出现在PIE-CVB3-GFP构建体，而STS△P10-CVB3-GFP构建体则无明显差异。

盐浓度实验表明，氯化钠浓度从0增加到100 mM对T4lig2-CVB3-GFP RNA的分离效率产生负面影响。对于PIE和STS构建体，低盐条件（10 mM NaCl）能轻微改善分离，但浓度超过25 mM后，SEC无法有效分离任何构建体的circRNA。

样品预处理的关键影响

研究发现，RNA纯化过程中的细微差异会显著影响HPLC-SEC的分离效果。快速冷却处理能使T4lig2-CVB3-GFP构建体的circRNA和前体峰更加尖锐，并减少PIE和STS构建体中内含子与大RNA物种的共洗脱。

特别重要的是，镁离子的存在严重干扰分离效果。在纯化的RNA样品中加入10 mM Mg²⁺会损害所有构建体的circRNA分离，导致更多内含子与前体和circRNA共 fractionation。对含镁样品进行快速冷却后，HPLC-SEC完全无法分离circRNA。而添加10 mM EDTA（乙二胺四乙酸）则能缓解这一问题。

直接从粗酶反应中纯化circRNA

基于以上发现，研究人员探索了省略HPLC-SEC前RNA纯化步骤的可能性。未纯化的PIE和STS IVT产物在30°C下分离效果差，内含子和circRNA与前体共洗脱。将柱温升至60°C后，分离分辨率显著提高，接近spin column纯化RNA样品的水平。

为彻底去除PIE-CVB3-GFP circRNA馏分中残留的内含子，研究人员结合了快速冷却、EDTA和甲酰胺添加策略。含有10 mM EDTA和50%甲酰胺的样品在注射前经过快速冷却，即使在高曝光PAGE胶中也检测不到内含子残留。

对于未纯化的RNase R处理样品，升高柱温同样改善了circRNA分离效果。由于无需纯化步骤，RNase R处理和未处理样品可直接通过HPLC-SEC比较，避免了spin column的RNA损失。RNase R选择性消化了原本在HPLC-SEC中与circRNA共洗脱的降解RNA，产生更尖锐的峰和更少的拖尾。

RNA交联破坏circRNA分离

为直接证明RNA变性在circRNA分离中的关键作用，研究人员在纯化前对T4lig2-CVB3-GFP circRNA和前体进行交联处理。AMT（4'-氨基甲基三氧沙仑盐酸盐）在365 nm紫外照射下能插入RNA双链，在嘧啶间形成光环加成，产生共价交联。

在2% EX琼脂糖凝胶上，交联增加了T4lig2-CVB3-GFP RNA的电泳迁移率，circRNA的条带位移大于线性前体。而在3.5%尿素PAGE中，交联降低了两种物种的迁移率，对线性RNA的影响更为明显。交联60分钟后，两种凝胶系统中circRNA和前体条带均发生重叠，表明多次交联事件使线性和环状RNA在结构上无法区分。

HPLC-SEC分析显示，在30°C下，交联的circRNA和线性前体馏分完全重叠。较高温度下它们部分分离，但保留时间差远小于非交联RNA。有趣的是，交联前体的峰随柱温升高而变宽，表明线性RNA比环状RNA结构约束更小，交联后采用更大的构象异质性。

讨论与展望

本研究深入探讨了体外合成circRNA与线性副产物分离的基本原理，证实了变性条件在凝胶电泳和HPLC尺寸排阻色谱中的关键作用。在天然条件下，RNA分子采用复杂结构，circRNA因环状拓扑可能形成更紧凑结构，在电泳中迁移略快于线性对应物，在SEC中因平均流体力学尺寸较小而较晚洗脱，但这些差异不足以实现有效分离。

在变性条件下，RNA分子结构展开，线性RNA被迫延伸成单链构象，以"蛇行"方式通过凝胶孔隙，而circRNA保持环状结构，穿越凝胶孔隙时摩擦增加，导致迁移明显变慢。在SEC中，线性和环状RNA都变得更加扩展，但由于环状拓扑的结构限制，即使完全变性，circRNA也只能达到其拉伸线性对应物最大长度的一半，从而在变性条件下产生更大的平均流体力学尺寸差异，提高分离效率。

研究还发现，低pH值（<4.5）和中性pH（7.5）条件下，45°C HPLC-SEC与Tris-EDTA流动相能改善T4连接和PIE生成circRNA的分离，而中间pH水平（5.5-6.5）效果较差。这可能是因为胞嘧啶N3位置的质子化（pKa 4.2）破坏了G-C对中的氢键，促进RNA分子变性。

镁离子的影响不容忽视，即使少量残留也会显著影响HPLC-SEC性能，导致PIE和STS circRNA馏分中的内含子滞留。这可能是由于内含子核酶序列与外显子引导序列的剩余碱基配对所致。柱加热结合EDTA螯合镁离子和甲酰胺 destabilizing RNA样品中的氢键，再经快速冷却避免分子间碱基配对，能有效解决这一问题。

尽管经过广泛优化，SEC纯化仍存在局限性：即使优化条件下也无法完全分离circRNA与较小副产物；上样量较大时分离效率降低；RNA在高温和柱基质剪切力下易降解；柱加热可能缩短色谱柱寿命。这些问题的存在表明，可扩展circRNA分离方法的进一步发展仍需持续推进。

值得注意的是，早在1970年代，科学家就已使用变性PAGE成功分离和分析体外合成circRNA。这一先驱性成就为研究circRNA提供了强大而直接的生化方法。随着mRNA疫苗的出现，合成circRNA研究重新兴起，但当前快速发展偶尔伴随着对基础RNA生物学知识关注的减少。本研究重新审视了已建立的概念，并进一步探索了circRNA分离的基本原理，这些发现将推动circRNA生物技术和治疗学的发展，为未来创新治疗策略铺平道路。