基于别构DNA酶的逻辑电路智能电化学发光生物传感器，用于急性心肌梗死的精准诊断

《Bioscience Reports》：An Allosteric DNAzyme-Based Logic Circuit Intelligent Electrochemiluminescence Biosensor for the Precise Diagnosis of Acute Myocardial Infarction

一种基于allosteric DNAzyme逻辑电路的新型ECL生物传感器开发成功，通过整合ECL-RET探针实现多种miRNA智能检测，灵敏度达62 aM，有效区分AMI与其他急性冠脉综合征，为临床诊断提供新思路。

　　急性心肌梗死（AMI）是一种威胁生命的医疗紧急情况，需要及时诊断和快速干预。然而，区分AMI与其他具有相似临床表现的冠状动脉疾病仍然是一个挑战。本研究开发了一种新型的电化学发光（ECL）生物传感器，通过将变构DNA酶纳米装置与ECL共振能量转移（ECL-RET）探针相结合，实现了对多种与不同冠状动脉疾病相关的微小RNA（miRNA）的智能分析。研究中构建了一系列基于DNA酶框架的DNA逻辑设备，包括YES、AND、OR和INHIBIT逻辑门。特别地，“INHIBIT-AND”逻辑电路能够执行复杂的信息处理，从而有效分析多种miRNA并智能区分与AMI相似的疾病。最终信号通过将Ru[(bpy)?]2?还原-氧化（R–O）发射体和CdTe量子点（QD）氧化-还原（O–R）发射体封装进DNA修饰的二氧化硅纳米颗粒中合成的ECL-RET探针进行检测。该传感平台能够智能检测多种miRNA，其检测限为62 aM（S/N = 3），范围从1 fM到1 nM。该策略被应用于患者血清样本，为AMI的自主和精确诊断提供了新思路。

在近年来的研究中，miRNA已被证明是诊断和预后AMI的有前景的生物标志物。DNA逻辑门是一种基于逻辑运算的分子计算机，具有独特的输出模式，可用于信息的多功能处理和算术运算。单一的基本DNA逻辑门，如YES、OR、AND和XOR逻辑门，其功能相对简单，难以满足对多种循环miRNA的识别和分析的需求。通过将多个逻辑门串联或并联形成的DNA逻辑电路，能够响应特定的miRNA，并借助其独特的优势，如高可编程性、高生物相容性和固有的分子识别特性，完成复杂任务，从而区分各种急性冠状动脉综合征。因此，DNA逻辑电路能够识别多种miRNA，使其成为智能区分具有相似症状的不同急性冠状动脉综合征的有前景的材料。

功能性核酸，如DNA酶、适配体、i-结构和G四链体，能够响应化学或生化刺激，常被用作逻辑运算单元，从而在生理环境中实现单个DNA逻辑门或复杂的逻辑运算。DNA酶具有良好的可编程性、高效的消化能力和简单的合成方法，使其成为实现DNA逻辑运算的合适工具。典型的DNA酶布尔逻辑门通过链置换反应调控DNA酶结构的构象变化，实现特定底物的切割。通过整合多种变构DNA酶，可以设计出基于变构DNA酶的多种布尔逻辑计算，从而实现miRNA的多功能信息处理。此外，基于链置换反应的变构DNA酶布尔逻辑计算结合了链置换反应和典型DNA酶的优点，具有优异的催化活性和放大效率，能够减少DNA酶非特异性背景信号的影响，降低电路泄漏的风险，从而提高检测的灵敏度和可靠性。

电化学发光（ECL）是一种通过电极上发光物与共反应物之间的协同氧化还原反应产生光发射的现象。ECL结合了电化学和光化学的优点，因其固有的高灵敏度、低背景噪声、操作简便和时空可控性，在免疫分析领域得到了广泛应用。基于生物标志物逻辑分析开发的ECL生物传感器被用于DNA逻辑计算。例如，Zhu等人结合DNA酶水解反应和双链特异性核酸酶切割电路，形成Ru(bpy)?2?标记的探针，以刺激HCR反应并构建双输入“AND”门，从而实现对AMI相关miRNA的灵敏检测。Han等人则开发了一种基于框架核酸的循环酶促信号放大驱动的DNA逻辑纳米装置，通过ECL探针连接反应实现了对双心肌miRNA的灵敏检测。发光试剂的选择对ECL检测性能至关重要。Ru(bpy)?2?是一种广泛研究的ECL试剂，因其高ECL效率、优异的稳定性和良好的生物相容性，在ECL生物传感领域具有广泛的应用。值得注意的是，当Ru(bpy)?2?作为还原-氧化（R–O）供体，并与氧化-还原（O–R）受体CdTe量子点结合时，Ru(bpy)?2?的ECL发射与CdTe量子点的紫外-可见吸收光谱之间的部分重叠会引发ECL共振能量转移（ECL-RET），从而提高电化学发光效率。大量Ru(bpy)?2?和CdTe QD对填充的二氧化硅纳米颗粒能够有效缩短供体与受体之间的电子转移路径，从而增加RET的可能性，并显著提高ECL的发光效率。

在本研究中，我们开发了一种基于变构DNA酶逻辑计算的高灵敏度ECL生物传感器，用于精确检测与AMI相关的多种miRNA，并智能区分AMI与其他急性冠状动脉综合征。为了提高生物传感器的稳定性，我们合成了SnO?/壳聚糖/g-C?N?纳米材料作为基底。如图1所示，电极被修饰为SnO?/壳聚糖/g-C?N?，并通过Au-N键将底物探针固定在纳米材料上。为了实现对多种心血管疾病相关miRNA的检测，目标miRNA作为逻辑输入，触发溶液中的DNA复合物进行链置换反应，形成环状结构。这种环状结构与探针结合，形成变构DNA酶，并继续在rA位点切割底物探针。对于多种简单的DNA逻辑门和“INHIBIT-AND”逻辑电路，所有对应于不同逻辑输入的目标miRNA及其DNA复合物都被混合并加入样品中。尽管不同的目标miRNA形成不同的环状单元，但它们都能与探针结合，形成变构DNA酶，并触发酶促消化反应，生成后续反应所需的触发链。然后，这些在电极上释放的触发链启动滚环扩增（RCA）过程，产生包含互补序列重复拷贝的DNA纳米螺旋。值得注意的是，不同miRNA驱动的变构DNA酶逻辑计算的组装能够实现信号放大，并为智能miRNA识别和诊断提供了一个有前景的工具箱。

为了进一步验证该生物传感器的性能，我们对SnO?/壳聚糖/g-C?N?纳米复合材料和CdTe-RuSi纳米颗粒进行了表征。使用透射电子显微镜（TEM）和高分辨率透射电子显微镜对g-C?N?、SnO?量子点和SnO?/壳聚糖/g-C?N?纳米复合材料的表面形貌进行了分析，并通过动态光散射（DLS）技术测定了SnO?量子点的平均水动力尺寸。如图2A所示，g-C?N?表现出光滑的层状结构，而SnO?量子点则均匀分散，其平均直径为3.7纳米（图2C）。此外，通过X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对材料的化学组成和表面官能团进行了分析，以确保其与探针之间的有效结合。同时，我们还评估了ECL-RET探针的发光性能，包括其发光强度、信噪比以及在不同浓度miRNA下的响应特性。实验结果表明，该ECL-RET探针具有优异的发光效率，并且能够对多种miRNA进行高灵敏度检测。

在实际应用方面，该生物传感器被成功应用于患者血清样本的检测。通过提取血清中的miRNA并将其与设计的DNA逻辑设备进行反应，我们能够实现对多种miRNA的同步检测，并通过ECL信号的变化来判断AMI与其他冠状动脉疾病的差异。实验结果表明，该传感器在真实样本中的检测性能良好，具有较高的特异性和灵敏度，能够准确区分AMI与其他类似疾病。此外，该方法还具有操作简便、成本低廉和可重复性强等优点，为临床快速诊断AMI提供了新的技术路径。通过将变构DNA酶逻辑计算与ECL-RET探针相结合，我们不仅提高了miRNA检测的灵敏度和特异性，还实现了对多种疾病标志物的智能识别和分析，为未来精准医疗的发展奠定了基础。

在本研究中，我们还探讨了该生物传感器的潜在应用前景。随着精准医疗和个性化治疗的发展，对多种生物标志物的同时检测需求日益增加。该ECL生物传感器能够通过逻辑运算实现对多个miRNA的识别，并结合ECL信号的放大特性，提高检测的准确性。此外，该方法还可以扩展至其他疾病的诊断，如癌症、神经系统疾病等，为多疾病标志物的联合检测提供了新的思路。通过优化DNA逻辑门的设计和ECL探针的性能，该传感器有望在临床环境中实现更广泛的应用。同时，该研究也为功能性核酸在生物传感领域的应用提供了新的方向，展示了其在复杂生物系统中进行信息处理和疾病诊断的潜力。

最后，我们总结了本研究的主要贡献和未来的研究方向。通过将变构DNA酶与ECL-RET探针相结合，我们成功开发了一种新型的智能ECL生物传感器，能够实现对多种miRNA的精确检测和疾病区分。该传感器具有高灵敏度、高特异性和良好的稳定性，为AMI的自主和精确诊断提供了有力的技术支持。未来的研究将进一步优化DNA逻辑门的设计，提高其在复杂生物环境中的响应能力，并探索该技术在其他疾病诊断中的应用。此外，我们还将致力于开发更高效的信号放大策略，以提高检测的灵敏度和动态范围，从而满足临床对高精度诊断的需求。通过不断改进和创新，我们相信该技术将在未来的生物医学研究和临床诊断中发挥重要作用。