用于测量尿素酶和尿素分解菌浓度的氨色度指示剂

《Bioscience Reports》：Ammonia colourimetric indicator for measuring urease and ureolytic bacteria concentrations

该方法利用BPB-LDPE氨气指示剂结合数字颜色分析（DCA）技术，开发两种新方法：（i）快速测定脲酶浓度，检测范围0-20 U/mL，灵敏度优于传统试剂盒；（ii）在好氧及厌氧条件下检测产脲细菌总活菌数（TVC），范围101-10? CFU/mL，并能排除非产脲菌（如大肠杆菌）干扰。创新点包括：①采用不可逆氨气指示剂延长检测时间窗口；②基于数字成像技术替代光谱仪，降低设备成本；③建立log(CFU/mL)与阈值时间（TT）的线性关系，实现自动化高throughput检测。实验验证了方法在复杂样品中的适用性，为临床和环境微生物检测提供新工具。

　　尿素酶是一种广泛存在于多种生物体中的酶，包括植物（如刀豆和大豆）、细菌（如幽门螺杆菌和变形杆菌属）以及真菌。它通过催化尿素的水解反应，将尿素分解为氨和二氧化碳。这一反应对于许多微生物的生长和生存至关重要，尤其是在病原菌中，尿素酶被视为一种关键的致病因子，因为它不仅有助于细菌在宿主体内的定植，还可能引发强烈的炎症反应。此外，尿素酶的活性还与毒素的释放、炎症的加剧以及生物膜的形成密切相关。因此，准确测定尿素酶的浓度或活性在医学诊断、农业和环境监测等领域具有重要意义。

目前，尿素酶活性的测定通常依赖于特定的试剂盒，如Sigma Aldrich提供的产品。这些方法虽然有效，但存在成本较高（每项检测约5.43英镑）以及需要使用昂贵的紫外-可见分光光度计等缺点。此外，传统的检测方法如Berthelot反应，虽然灵敏度高，能够检测0至25单位/升的尿素酶活性，但操作繁琐且耗时较长，通常需要4小时以上才能完成检测。因此，寻找一种更快速、经济且易于操作的检测方法成为研究的热点。

近年来，一些研究团队尝试使用基于颜色变化的氨（NH?）气体指示剂来测定尿素酶活性。这类方法通常利用一种pH指示剂（如HD）溶解在挥发性有机溶剂和聚合物（如乙基纤维素）中，形成一种敏感的指示剂薄膜。当该薄膜暴露于氨气时，会因pH变化而发生颜色改变。然而，这类指示剂在水中使用时容易发生染料泄漏，因此在实际应用中需要通过封装或其他方式来增强其稳定性。一种经过改进的封装型NH?指示剂（BPB-LDPE）因其在水溶液中表现出良好的稳定性和高灵敏度而受到关注。

BPB-LDPE指示剂在空气中表现出几乎不可逆的颜色变化特性，这使其在连续监测氨浓度时具有优势。通过数字图像分析（DCA）技术，研究人员能够从照片中提取出指示剂的“表观吸光度”A’，该值与实际的吸光度A具有良好的相关性。这一发现使得使用数字摄影替代传统的分光光度计成为可能，从而大大降低了检测成本。同时，由于颜色变化过程可以实时监测，这种方法在分析时间上也具有显著优势，能够更快地获取数据。

在测定尿素酶浓度的实验中，研究人员将BPB-LDPE指示剂置于含有尿素和待测尿素酶样品的溶液中，并在不同时间点拍摄照片。通过DCA分析照片，研究人员绘制了A’与时间t的曲线，从中确定了指示剂达到半程颜色变化点所需的时间t??。由于t??与尿素酶浓度成反比，研究人员可以据此计算出尿素酶的浓度。实验结果显示，该方法能够有效测定尿素酶的浓度范围在0至20单位/毫升，并且其检测限约为1单位/毫升，与现有方法相比具有更高的灵敏度和更低的成本。

在测定尿素酶产生菌的总活菌数（TVC）方面，研究人员开发了一种基于氨的微呼吸法（NH? μR-TVC）。该方法的基本原理是利用尿素酶产生的氨气体作为指示信号，通过监测指示剂的颜色变化来评估细菌的生长情况。与传统的氧气微呼吸法（O? μR-TVC）不同，NH? μR-TVC能够在有氧和无氧条件下测定尿素酶产生菌的TVC，甚至在存在非尿素酶产生菌（如大肠杆菌）的情况下也能实现选择性检测。这是因为尿素酶产生的氨气体与非尿素酶产生的气体（如氧气）在反应机制和检测信号上存在显著差异，从而使得NH? μR-TVC方法能够区分不同类型的细菌。

为了验证NH? μR-TVC方法的有效性，研究人员在不同条件下进行了多项实验。在有氧条件下，他们使用含有不同浓度尿素酶产生菌（如P. stuartii和P. mirabilis）的CU培养基，并在不同时间点拍摄指示剂的颜色变化情况。通过DCA分析，研究人员绘制了A’与时间t的曲线，并从中计算出半程颜色变化点（TT）。实验结果显示，TT与细菌浓度的对数成正比，表明该方法具有良好的线性响应和可重复性。即使在存在非尿素酶产生菌的情况下，如大肠杆菌，NH? μR-TVC方法仍然能够准确地测定尿素酶产生菌的TVC，这进一步证明了其在复杂样本中的适用性。

在无氧条件下，研究人员通过向培养基中添加氧气清除剂（如亚硫酸钠）来创造无氧环境，并使用相同的实验方法进行测试。结果显示，NH? μR-TVC方法同样适用于无氧条件下的细菌浓度测定，表明其具有广泛的适用性。此外，研究人员还测试了该方法在真实环境样本（如河流水样）中的表现，发现其与在CU培养基中的表现相似，进一步验证了其在实际应用中的可靠性。

综上所述，NH? μR-TVC方法不仅能够快速、经济地测定尿素酶产生菌的TVC，而且在有氧和无氧条件下均表现出良好的性能。该方法通过利用氨气体作为检测信号，克服了传统方法在环境复杂性方面的局限性，为微生物检测提供了一种新的思路。此外，该方法在实际应用中展现出良好的可重复性和准确性，未来有望在临床和环境监测等领域得到广泛应用。