综述：提高基于细胞产品的冷冻保存过程稳定性的策略

《Biotechnology Advances》：Strategies to enhance stability of cryopreservation processes for cell-based products

细胞基产品（CBPs）冷冻保存需综合考虑制造规模化与生物稳定性，重点优化分装、冷冻、存储及解冻流程，并引入模拟技术构建数字孪生模型以提升效率。

　　在当今生物医学技术迅速发展的背景下，细胞制造已成为再生医学和细胞治疗领域的重要支柱。随着全球细胞制造市场以每年25.5%的复合增长率持续扩张，预计到2027年将达到5.58亿美元（Bahari等，2023），这一趋势凸显了建立稳定、高效且可扩展的细胞基产品（CBP）供应链的紧迫性。CBP不仅包括分离的细胞，还涵盖了三维结构如细胞团和类器官，这些产品在细胞制造流程中可能作为起始材料、中间产物或最终产品，根据具体应用场景而定。因此，CBP的制造和保存技术需要兼顾工程与生物学方面的考量，以确保其在不同规模生产中的质量一致性。

CBP的制造流程可以分为上游、下游和出库三个主要阶段。上游阶段主要关注于细胞数量的增加，涉及培养基制备、细胞扩增及分化等操作。随着细胞培养技术的不断进步，如用于间充质干细胞（MSCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）的规模化培养方法，这些技术已逐步走向成熟（Jankovic等，2023；Lee等，2022）。特别是在临床试验验证后，MSCs和iPSCs的培养技术被认为是未来细胞治疗领域的重要基石。然而，尽管上游技术已取得显著进展，下游技术的可扩展性仍然面临诸多挑战。下游流程涉及细胞产品的分离、纯化、装填、冷冻和包装等步骤，其关键在于如何在不损害细胞活性的前提下实现大规模、稳定的保存。因此，如何优化下游流程，特别是在冷冻保存环节，成为当前研究的重点。

冷冻保存作为CBP制造中的关键环节，旨在通过低温环境延长细胞的保存时间，同时维持其生物学功能。然而，冷冻过程中涉及复杂的物理和生化变化，如细胞内外的冰晶形成、细胞膜损伤以及代谢活动的变化，这些因素都可能影响CBP的质量。因此，冷冻保存技术需要精准控制过程参数，以减少细胞损伤并确保长期保存的稳定性。冷冻过程通常包括缓慢冷却和玻璃化两种方法。缓慢冷却过程中，细胞悬浮液在低温保护剂（CPAs）的辅助下逐渐降温，以避免冰晶形成对细胞结构的破坏。而玻璃化技术则通过快速降温使细胞液态变为非晶态，从而防止冰晶的生成。这两种方法各有优劣，需要根据具体细胞类型和应用需求进行选择。

在冷冻保存过程中，低温保护剂的选择与使用是决定CBP质量稳定性的关键因素之一。CPAs的作用在于降低冰晶形成的风险，同时减少细胞在冷冻过程中的损伤。然而，CPAs的使用也伴随着一些潜在问题，如毒性作用和渗透压变化。因此，如何在保护细胞活性的同时，降低CPAs对细胞的负面影响，成为研究的重要方向。此外，冷冻保存的装填过程也需高度关注，以确保细胞悬液在容器中的均匀分布和适当密度，从而避免因装填不当导致的细胞损伤。目前，手动装填仍为常见方式，但其存在操作时间长、装填精度低等问题，因此自动化装填技术正逐步被引入以提高效率和一致性。

冷冻保存后的存储阶段同样至关重要。存储温度的选择直接影响CBP的长期稳定性，通常需要将细胞保存在低于其玻璃化转变温度的环境中。在此温度下，细胞的代谢活动几乎停止，从而延长其保存时间。然而，过低的温度可能导致细胞结构的破坏，因此需要找到一个平衡点，既能有效抑制冰晶形成，又不会对细胞造成不可逆损伤。此外，存储容器的材料和设计也需符合低温保存的要求，以减少外界环境对细胞的干扰。

在CBP的使用阶段，解冻和低温保护剂去除过程是确保细胞活性和功能恢复的关键步骤。解冻过程中的温度变化可能引发细胞膜破裂、细胞内水分重新分布等问题，因此需要控制解冻速率，以避免细胞损伤。同时，CPAs的去除也需谨慎处理，以防止因残留保护剂对细胞功能的干扰。目前，常用的去除方法包括洗涤、离心和透析等，这些方法的选择需根据细胞类型和保存条件进行优化。

随着细胞制造需求的不断增长，冷冻保存技术的可扩展性变得尤为重要。传统的冷冻保存方法往往难以满足大规模生产的需求，因此需要开发更加高效和稳定的工艺流程。近年来，模拟技术的应用为冷冻保存过程的设计与优化提供了新的思路。通过计算机辅助工艺设计（CAPD），研究人员可以在虚拟环境中测试不同的冷冻参数和操作条件，从而减少实验成本和时间，提高工艺的可靠性。此外，数字孪生技术的应用也使得冷冻保存过程的预测和控制更加精准，有助于建立更加智能化的细胞制造体系。

在CBP的供应链管理中，冷冻保存技术的作用不可忽视。它不仅能够实现细胞产品的长期保存，还为细胞制造的灵活性提供了保障。例如，通过冷冻保存，可以建立大规模的细胞库，从而应对不同患者群体的需求变化。此外，冷冻保存还能够克服供应链中的时空限制，使得细胞产品能够在不同地点之间灵活运输和分配。这种灵活性对于标准化治疗和个性化治疗都具有重要意义，尤其是在医疗资源分布不均的地区，冷冻保存技术可以显著提高细胞治疗的可及性。

综上所述，冷冻保存技术是细胞制造过程中不可或缺的一环，其核心在于如何在不同阶段控制细胞的状态，以确保CBP的质量稳定。从装填、冷冻、存储到解冻，每一个环节都需要科学的设计和优化。同时，随着市场和技术的发展，冷冻保存技术的可扩展性和智能化将成为未来研究的重点。通过结合先进的模拟技术，研究人员可以更高效地设计和优化冷冻保存流程，从而推动细胞治疗领域的进一步发展。