利用环境DNA优化濒危陆封港海豹（Phoca vitulina mellonae）的分布特征并确认其系统发育关系

《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》：Refining the distribution and confirming the phylogenetic relationship of the endangered landlocked harbour seal Phoca vitulina mellonae using environmental DNA

本研究通过环境DNA（eDNA）技术，结合社区采样网络，分析了加拿大努纳维克地区濒危海豹亚种Phoca vitulina mellonae的分布特征和线粒体DNA多样性。开发了探针式qPCR和metabarcoding两种检测方法，揭示了采样体积、月份和距离对eDNA检测的影响，确认了该亚种在物种全球遗传多样性中的独特地位，并验证了eDNA在偏远地区濒危物种监测中的应用潜力。

　　### 研究背景与意义

在生态系统保护和生物多样性研究中，准确地了解濒危物种的分布情况对于制定有效的保护策略至关重要。许多濒危物种的生存状况受到栖息地变化、气候变化以及人类活动的影响，因此，掌握其分布范围不仅有助于评估种群健康状况，还能为政策制定和保护措施提供科学依据。然而，传统的物种调查方法，如船只或飞机观测、被动声学监测等，往往成本高昂且存在较高的不确定性，尤其是在对数量稀少或栖息地隐蔽的物种进行调查时。这些方法通常需要较大的人力和物力投入，并且在某些情况下可能无法准确反映物种的真实分布情况。

近年来，环境DNA（eDNA）技术的兴起为解决这一问题提供了新的途径。eDNA是指从环境样本中收集的DNA，无需直接接触生物体即可用于检测其存在。这种方法不仅减少了对物种的干扰，还提高了检测的灵敏度，特别是在调查稀有物种时具有显著优势。在本研究中，科学家们致力于利用eDNA技术来提高对濒危物种——湖栖海豹（*Phoca vitulina mellonae*）的调查能力。该物种生活在加拿大魁北克北部的湖泊生态系统中，数量估计在50至600只之间，属于濒危物种，受到加拿大《濒危物种法》的保护。

湖栖海豹的分布范围被推测为覆盖了超过55度纬线以北的多个相连湖泊，其生存状况受到多种因素的影响，包括栖息地、资源利用、社会行为以及人类活动等。因此，为了更全面地了解其分布情况和种群结构，研究人员开发了一种基于探针的定量PCR（qPCR）检测方法，用于判断该物种的存在，以及一种基于宏条形码的检测方法，用于评估其线粒体DNA（mtDNA）的多样性。这些方法的结合不仅能够提供物种分布信息，还能揭示其遗传多样性，从而为保护策略提供更深入的参考。

此外，本研究还强调了与当地原住民社区合作的重要性。原住民知识和历史记录为确定湖栖海豹的潜在栖息地提供了重要线索，同时，通过与社区成员的协作，研究人员能够更有效地在偏远地区进行样本采集，从而扩大了调查范围。这种跨学科、跨文化的合作模式为濒危物种的保护研究提供了新的视角和方法，也为未来的研究提供了可借鉴的经验。

### 研究方法与技术细节

为了更有效地调查湖栖海豹的分布和遗传多样性，研究人员构建了一个由科学家和非科学家组成的协作网络，覆盖了魁北克北部的五个流域。这个网络包括了当地原住民政府、魁北克省政府以及相关的科研机构，确保了样本采集工作的全面性和可持续性。由于研究区域位于偏远地区，无法通过公路到达，因此研究人员主要依靠航空运输进行实地调查，并通过视频会议和视频教学对参与人员进行培训，以确保采样过程的标准化和减少污染风险。

在样本采集过程中，研究人员采用了两种不同的采样方法：一种是从直升机上直接采集水样，另一种是从岸边进行采集。直升机采样时，使用了重力装置使水瓶下沉到水面附近，以获取尽可能多的DNA样本。岸边采样则是在距离岸边几米的位置直接采集表层水样，或者通过过滤设备进行现场过滤。为了确保采样过程的准确性，采样人员在采样前会使用10%的次氯酸钠溶液对靴子进行去污染处理，以防止外部DNA污染。

样本采集完成后，研究人员在专门的eDNA超清洁实验室中进行DNA提取和检测。为了减少污染风险，实验室的空气系统采用了正压设计，确保在提取和PCR准备过程中不会受到外部污染。所有进入实验室的材料和样本容器都会在SAS（样品处理区）进行去污染处理。DNA提取过程使用了优化的QIAGEN DNeasy? Blood and Tissue提取协议，以提高DNA的纯度和提取效率。对于2020年至2023年的样本，研究人员选择了TRIS缓冲液替代含EDTA的AE缓冲液，以避免PCR抑制。

在DNA检测方面，研究人员开发了一种基于探针的qPCR检测方法，用于高灵敏度和特异性地检测湖栖海豹的DNA。该方法针对线粒体DNA的控制区（D-loop）进行设计，因为这一区域在全球范围内已被广泛研究，并且具有较高的种间区分度。为了确保检测方法的可靠性，研究人员在体外和体内进行了多方面的测试，包括使用相关哺乳动物的DNA进行特异性验证，以及通过标准曲线确定检测和定量的下限。此外，该方法还通过统计建模对检测概率进行了估计，确保了其在实际应用中的有效性。

为了进一步研究湖栖海豹的遗传多样性，研究人员还开发了一种宏条形码检测方法。该方法使用了线粒体DNA控制区的309个碱基对片段，并通过两步PCR进行扩增。在PCR过程中，研究人员对反应条件、DNA提取体积和反应混合物进行了优化，以提高扩增的成功率。最终，通过宏条形码分析，研究人员获得了多个精确的序列变异（ESVs），并发现这些序列与历史组织样本中的序列相似，表明该方法能够有效揭示湖栖海豹的线粒体DNA多样性。

### 研究结果与分析

通过eDNA检测，研究人员发现湖栖海豹的DNA在五个流域中被检测到，包括Lacs des Loups Marins、Lac Minto、Lac Bourdel、Nastapoka River和Lac Bienville。这些水体中，部分已被列为湖栖海豹的“关键栖息地”，而其他则被认为是潜在的栖息地。此外，研究人员还发现，eDNA的拷贝数受到采样月份和水体积的影响，并且与距离海豹的距离呈负相关。这意味着，在距离海豹较近的采样点，eDNA的拷贝数较高，而在较远的区域则较低。这一发现对于优化采样策略和提高检测准确性具有重要意义。

为了进一步验证这些结果，研究人员使用了零膨胀广义线性混合模型（ZIGLM）对eDNA检测数据进行了分析。模型的结果表明，采样月份和水体积是影响eDNA检测的关键因素。在春季，由于湖栖海豹的繁殖和换毛活动，DNA的浓度较高，而夏季由于海豹的分散活动，DNA的检测率较低。此外，研究还发现，增加采样体积有助于提高DNA浓度，从而提高检测成功率。然而，由于样本量的不均衡和采样设计的局限性，研究结果在一定程度上受到这些因素的影响，未来需要进一步优化采样策略。

在遗传多样性分析方面，宏条形码检测方法揭示了湖栖海豹的线粒体DNA多样性情况。研究人员获得了三个不同的ESV，并发现这些序列与历史组织样本中的序列相似，支持了湖栖海豹的“陆封”假说。这一假说认为，湖栖海豹由于地理隔离而形成了独特的种群结构。此外，研究还发现，湖栖海豹的DNA在不同的水体中呈现出不同的分布模式，这可能与其栖息地的环境特征有关，例如水体的流动性和水体的大小。

### 讨论与意义

本研究的结果表明，eDNA技术在调查稀有和濒危物种方面具有显著优势。通过eDNA检测，研究人员能够在偏远地区高效地收集数据，并减少对物种的干扰。此外，eDNA方法的高灵敏度使其能够检测到低密度物种的存在，从而为保护措施提供更准确的依据。然而，eDNA技术也存在一些局限性，例如无法提供准确的种群数量估计，以及可能受到环境因素和PCR抑制的影响。

尽管如此，eDNA技术的使用为濒危物种的保护研究提供了新的视角和工具。通过与当地原住民社区的合作，研究人员不仅扩大了采样范围，还提高了数据的准确性和可靠性。这种跨学科的合作模式为未来的研究提供了重要的参考，尤其是在资源有限和地理条件复杂的情况下。

此外，本研究的结果还对eDNA技术的应用提出了改进建议。例如，为了提高宏条形码检测方法的效率，可以考虑缩短目标DNA片段的长度，以减少DNA降解的影响。同时，增加采样体积可能有助于提高DNA浓度，从而提高检测成功率。这些改进措施将有助于进一步优化eDNA技术在濒危物种调查中的应用。

总的来说，本研究展示了eDNA技术在调查稀有物种分布和遗传多样性方面的潜力，并强调了与原住民社区合作的重要性。通过这些方法，研究人员能够更全面地了解湖栖海豹的生存状况，并为保护措施提供科学依据。未来的研究可以进一步优化采样策略和检测方法，以提高eDNA技术在濒危物种保护中的应用效果。