《Cancer Letters》：Mitochondria-located circRCP regulates redox homeostasis via stabilizing LRPPRC/SLIRP complex to promote bladder urothelial carcinoma tumorigenesis
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膀胱尿路上皮癌（UCB）中线粒体环RNA circRCP的上调促进肿瘤发生，通过形成circRCP/LRPPRC/SLIRP三元复合体稳定LRPPRC蛋白，抑制线粒体氧化应激并诱导细胞凋亡。临床数据显示circRCP高表达与患者不良预后显著相关。
周昭辉|文俊华|张元哲|姚凯|李志勇|李向东|王彦军|江丽娟|叶云林|秦子科|刘卓伟|周方健|陈日新|谢丹|魏文素
中国南方肿瘤国家重点实验室，广东省癌症临床研究中心，中山大学癌症中心癌症医学协同创新中心，广州，中国
摘要
线粒体内 circular RNA（circRNA）在膀胱尿路上皮癌（UCB）发病机制中的作用仍很大程度上尚未被探索。本研究从 UCB 细胞的核基因组中鉴定出一种位于线粒体的 circRNA，命名为 circRCP。它在 UCB 中频繁上调，并作为独立的预后因素。进一步研究表明，circRCP 通过调节细胞内氧化还原稳态来促进 UCB 肿瘤发生。敲低 circRCP 会增加线粒体氧化应激，从而产生活性氧（ROS），进而触发 UCB 细胞凋亡。机制上，circRCP 通过形成 circRCP/LRPPRC/SLIRP RNA-蛋白质三元复合物，增强 LRPPRC/SLIRP 的稳定性，并保护其免受泛素化和蛋白酶体降解。临床上，circRCP 和 LRPPRC 表达水平高的 UCB 患者预后最差。综上所述，我们发现了一种位于线粒体的 circRNA，它能保护 UCB 细胞免受氧化应激，这突显了其在 UCB 病理中的潜在作用，值得进一步研究其治疗应用价值。
引言
膀胱癌是全球第九大常见癌症，2018 年约有 61.4 万新发病例和 22 万死亡病例 [1]。尿路上皮癌（UCB）是其主要亚型。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）占 UCB 病例的约 75%，对经尿道切除术（TUR）联合膀胱灌注化疗（BCG）等治疗方法反应良好 [2]，但晚期病例反应较差 [3]。剩余的 25% 为肌层浸润性（MIBC）或转移性膀胱癌 [4]。尽管外科和药物治疗有所进展，约 50% 的 UCB 患者在 2 年内会出现转移或复发 [5]，[6]。因此，深入了解 UCB 的肿瘤发生和进展对于开发更好的治疗方法至关重要。
线粒体作为代谢能量工厂、生物合成中心以及信号传导器官，在肿瘤适应环境方面起着关键作用 [7]。最新证据表明，线粒体在 ATP 生成（生物能量）和细胞凋亡（细胞命运）中发挥关键作用 [8]。所谓的“内在”凋亡途径通过活性氧（ROS）等细胞死亡信号在线粒体膜上被激活 [8]，[9]。线粒体电子传递链（ETC）复合体是 ROS 的主要来源；过多的 ROS 会引发细胞凋亡 [10]，[11]。线粒体稳态对细胞存活至关重要 [12]。因此，深入了解线粒体生物物理过程对于创新癌症疗法至关重要 [12]，[13]。
线粒体具有自我复制的、独立于细胞核的基因组，但大多数线粒体蛋白由细胞核编码。线粒体基因组仅编码部分呼吸链蛋白：NADH 还原酶（mt-ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）、细胞色素 c 氧化酶（mt-CO1、2、3）、ATP 合成酶（mt-ATP6、8）和细胞色素 b（mt-CYB）[14]。高通量 RNA 测序从这两个基因组中鉴定出许多线粒体非编码 RNA（ncRNA）。细胞核编码的蛋白质和 ncRNA 被导入线粒体，这对线粒体生物发生稳态至关重要 [15]。
circRNA（环状 RNA）是一种具有共价闭合末端的非编码 RNA，具有多种功能，并可作为生物标志物和治疗靶点 [16]，[17]，[18]，[19]，[20]。机制上，它们可作为 miRNA 的结合伴侣和蛋白质支架，在转录和转录后水平调节基因表达，或翻译成肽 [21]。虽然 circRNA 主要存在于细胞质或细胞核中，但一些核源性 circRNA 会定位于线粒体，例如心肌细胞中的 circSamd4 和 ESCC 细胞中的 circPUM1 [22]，[23]。然而，线粒体定位的 circRNA 在 UCB 中的作用尚未完全明了。
先前的研究表明，富含亮氨酸的五肽重复序列蛋白（LRPPRC）可稳定线粒体 ETC 功能，调节氧化还原稳态以促进 UCB 细胞存活和肿瘤发生 [24]。LRPPRC/SLIRP 复合物作为全局线粒体 mRNA（mt-mRNA）伴侣，促进多聚腺苷酸化和翻译 [24]，[25]，[26]，[27]。SLIRP 通过 RNA 依赖的 RRM-PPR 蛋白相互作用稳定 LRPPRC [27]，但介导该作用的 RNA 类型尚未确定。
在本研究中，我们发现 UCB 细胞中定位的 circRCP 是 UCB 病理的关键致癌因素。临床上，circRCP 的过表达是 UCB 患者预后不良的重要独立预测指标。功能研究表明，circRCP 影响 UCB 细胞的氧化还原稳态；其敲低会增加 ROS 积累并激活线粒体凋亡途径。机制上，circRCP 稳定 LRPPRC/SLIRP 复合物，调节其泛素化和降解，从而影响 UCB 细胞的线粒体功能。circRCP 和 LRPPRC 的高共表达与更具侵袭性的 UCB 和更差的预后相关。总体而言，我们的数据突显了 circRCP 在 UCB 肿瘤发生和进展中的关键作用。
患者和组织样本
本研究获得了中山大学癌症中心（SYSUCC）机构审查委员会的批准，符合《赫尔辛基宣言》的要求。所有涉及人类研究参与者的研究均以盲法进行。
本研究使用了 2008 至 2016 年间在 SYSUCC 接受根治性膀胱切除术的 139 名 UCB 患者的 UCB 组织及其匹配的正常组织。患者临床信息汇总在补充表 1 中。肿瘤分期和分级遵循 WHO 标准。
circRCP 在 UCB 中上调，与患者的晚期临床分期和不良预后相关
我们通过微阵列分析三对 UCB 和匹配的非肿瘤组织，基于以下标准鉴定出 14 个上调的 circRNA：1）log2（倍数变化）≥2，P<0.05，2）每对组织中均上调，3）原始强度>100（图 1A-B）。接下来，在 15 名 UCB 患者的组织中评估了这 14 个 circRNA 的表达情况；其中 circRCP、circPOLA2、circFOXRED1、circPRRC2B、circEVC2 和 circVDAC3 在与非肿瘤组织中上调（补充图 1A）。
讨论
在本研究中，我们发现 circRCP（位于 RCP 的外显子 2 区域）是一种促进 UCB 肿瘤发生的线粒体定位 circRNA。circRCP 在 UCB 患者中频繁上调，与较差的预后相关。体内 和 体外 实验表明，circRCP 促进 UCB 细胞增殖并抑制凋亡。机制上，circRCP 通过形成 circRCP/LRPPRC/SLIRP 三元复合物来稳定 LRPPRC，从而驱动 UCB 肿瘤发生。
CRediT 作者贡献声明
刘卓伟：写作 – 审稿与编辑。秦子科：写作 – 审稿与编辑。叶云林：数据管理。姚凯：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，监督，方法学。张元哲：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，研究。谢丹：概念构思。文俊华：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，方法学，研究。陈日新：方法学，概念构思。周昭辉：
伦理批准和参与同意
所有动物实验均按照中山大学癌症中心动物护理和使用委员会批准的方案进行。本研究符合中山大学癌症中心的机构研究伦理委员会要求。
支持数据的可用性
本研究中的 RNA-Seq 数据已存入 SRA 数据库，生物项目编号为 GSE243127。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号 82203288，W.S. Wei）的资助。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢患者和小鼠为这项研究所做的贡献和牺牲。
