《Cellular Signalling》：COL1A1 promotes clear cell renal cell carcinoma progression through the Wnt/β-catenin signaling pathway
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本研究阐明紫草素通过靶向抑制PLK1并调节β-catenin/EMT信号通路，抑制口腔鳞癌细胞增殖并诱导凋亡的分子机制。
斯图蒂·比斯瓦尔（Stuti Biswal）| 苏鲁蒂·比斯瓦尔（Sruti Biswal）| 比贝卡南德·马利克（Bibekanand Mallick）| 比杰什·K·比斯瓦尔（Bijesh K. Biswal）
印度奥里萨邦鲁尔凯拉（Rourkela）国家技术学院生命科学系癌症药物抗性实验室，邮编769008
摘要
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，其特点是预后不良、复发频繁且有效的治疗选择有限。从Lithospermum erythrorhizon植物根中提取的生物活性萘醌衍生物——紫锥菊素（Shikonin，简称Shk），已被证明是一种有效的抗癌化合物；然而，其在OSCC中的确切分子靶点和作用机制尚未完全阐明。本研究旨在通过识别参与口腔肿瘤进展的潜在靶点，来阐明紫锥菊素的抗癌活性背后的分子机制。计算机模拟筛选显示，Polo样激酶1（PLK1）是一种在癌症中经常过度表达的关键有丝分裂调节因子，可能是紫锥菊素的作用靶点。后续实验验证表明，紫锥菊素显著抑制了OSCC细胞的增殖，诱导了细胞凋亡，并引发了细胞周期停滞。机制研究进一步揭示，紫锥菊素通过调节β-连环蛋白/上皮-间充质转化（EMT）轴，下调了PLK1的表达并干扰了其下游信号传导，从而增强了DNA损伤、线粒体功能障碍和凋亡反应。值得注意的是，siRNA介导的PLK1沉默实验再现了这些表型效应，证实PLK1是紫锥菊素抗肿瘤作用的关键介导因子。综上所述，这些发现提供了有力证据，表明紫锥菊素通过调控β-连环蛋白/EMT信号通路，靶向抑制PLK1来发挥其抗癌作用，显示出其作为口腔癌治疗候选药物的潜力。
引言
口腔癌是最难治疗的癌症类型之一。目前的治疗手段包括手术、放疗和化疗，其中化疗单独使用或与其他治疗联合使用最为常见[1,2]。然而，尽管有这些先进的治疗方法，口腔癌的5年生存率仍低于50%，这常常让患者感到沮丧。这一低生存率主要是由于治疗抵抗性和化疗的严重副作用[3]。为了解决这些问题，研究人员转向了基于植物的天然疗法，因为它们具有较高的疗效且副作用较少[4,5]。从Lithospermum erythrorhizon植物根中提取的萘醌化合物紫锥菊素（Shk）显示出强烈的药理活性，包括抗癌作用[6]。然而，紫锥菊素的作用机制仍不清楚。
研究表明，口腔癌的发展和进展涉及多个通路、转录因子和激酶[7,8]。Polo样激酶（PLK）是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，人类PLK家族包括五个成员：PLK1、PLK2、PLK3、PLK4和PLK5[13]。它们在癌细胞生长和进展中起着重要作用[12]。在这五个成员中，PLK1被研究得最为广泛。该家族在调节细胞周期、DNA损伤反应、有丝分裂和胞质分裂中起着关键作用。它们的功能障碍与癌症和其他疾病密切相关，使其成为治疗干预的重要靶点。
PLK1（Polo样激酶1）在细胞周期中扮演多个关键角色，如调节有丝分裂进入、G2/M检查点、中心体功能、纺锤体组装、染色体分离和胞质分裂。它还支持DNA复制，并确保减数分裂期间的正常细胞分裂。这些功能有助于维持精确的细胞分裂和基因组稳定性[14]。重要的是，PLK1在许多类型的癌症中过度表达，其高水平与不良预后相关。PLK1通过促进侵袭性和帮助癌细胞逃避凋亡来促进癌症进展。观察发现，在大多数癌症中，PLK1表现为癌基因；但在APC截短的结肠癌细胞中，PLK1则表现为肿瘤抑制基因[15]。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，PLK1的作用通过TGF-β信号通路得到增强，导致转移增加，从而预后较差[16,17]。在胃癌中，PLK1通过调节β-连环蛋白-EMT通路轴，促进细胞增殖、转移和侵袭[20], [21], [22]。此外，在结直肠癌中，抑制PLK1-MYC-CDC7介导的细胞周期轴可增强奥沙利铂的敏感性，成为与化疗联合使用的有效治疗选择[23,24]。在去势抵抗性前列腺癌中，PLK1的抑制提高了BET表观遗传读取器的阻断效率，从而通过抑制癌症生长和增殖实现重新敏感化[25]。这些文献表明，PLK1的失调在癌症发展和进展中起着关键作用。然而，PLK1在口腔癌细胞中的失调及其作用机制尚不清楚。
因此，本研究旨在探讨口腔癌细胞中PLK1的表达情况，并检查其在口腔癌细胞生长和增殖中的机制作用。同时，还研究了PLK1是否是紫锥菊素治疗口腔癌的有效靶点。本研究的结果将为开发一种针对PLK1及其下游成分的新药物提供新的见解。
部分摘录
化学品和试剂
本研究中使用的化学品和试剂包括Triton X-100、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、溴化乙锭（EtBr）、4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和吖啶橙（AO），均由印度Himedia Laboratories Pvt. Ltd.提供。罗丹明-123、氰基碳酰基-m-氯苯腙（CCCP）和二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA）购自美国Sigma-Aldrich公司。引物（β-actin、Bax、BCL2、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimentin和ZO1）由Integrated DNA Technologies (IDT)提供紫锥菊素靶基因的预测
通过对11个口腔癌微阵列数据集进行分析，筛选出|logFC|≥1且-值≤0.05的基因，共发现3286个上调基因，其中22个基因已在CTD数据库中被报道为紫锥菊素的靶点。排除这些已报道的基因后，继续分析剩余的3268个上调基因。使用Enricher对这些基因进行通路富集分析，发现110个上调基因富集在58个与肿瘤发生过程相关的统计显著通路中。
讨论
口腔癌是最可怕的癌症类型之一。尽管有这些先进的治疗手段，口腔癌患者的5年生存率仍低于50%，这令患者感到沮丧[33]。这主要是由于治疗抵抗性和化疗的副作用。因此，为了克服这些问题，研究人员正在关注基于植物的天然疗法，因为它们副作用少且疗效高[4,5]。紫锥菊素（Shk）是一种从Lithospermum erythrorhizon植物根中提取的萘醌化合物，具有强烈的药理活性，包括抗癌作用[6]。然而，紫锥菊素的作用机制仍不清楚。
研究表明，口腔癌的发展和进展涉及多个通路、转录因子和激酶[7,8]。Polo样激酶（PLK）是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。人类PLK家族包括五个成员：PLK1、PLK2、PLK3、PLK4和PLK5[13]。它们在癌细胞生长和进展中起着重要作用[12]。在这五个成员中，PLK1被研究得最为广泛。该家族在调节细胞周期、DNA损伤反应、有丝分裂和胞质分裂中起着关键作用。它们的功能障碍与癌症和其他疾病密切相关，使其成为治疗干预的重要靶点。
PLK1在细胞周期中扮演多个关键角色，如调节有丝分裂进入、G2/M检查点、中心体功能、纺锤体组装、染色体分离和胞质分裂。它还支持DNA复制，并确保减数分裂期间的正常细胞分裂。这些功能有助于维持精确的细胞分裂和基因组稳定性[14]。重要的是，PLK1在许多类型的癌症中过度表达，其高水平与不良预后相关。PLK1通过促进侵袭性和帮助癌细胞逃避凋亡来促进癌症进展。在大多数癌症中，PLK1表现为癌基因；但在APC截短的结肠癌细胞中，PLK1表现为肿瘤抑制基因[15]。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，PLK1的作用通过TGF-β信号通路得到增强，导致转移增加，从而预后较差[16,17]。在胃癌中，PLK1通过调节β-连环蛋白-EMT通路轴，促进细胞增殖、转移和侵袭[20], [21], [22]。此外，在结直肠癌中，抑制PLK1-MYC-CDC7介导的细胞周期轴可增强奥沙利铂的敏感性，成为与化疗联合使用的有效治疗选择[23,24]。在去势抵抗性前列腺癌中，PLK1的抑制提高了BET表观遗传读取器的阻断效率，从而通过抑制癌症生长和增殖实现重新敏感化[25]。这些文献表明，PLK1的失调在癌症发展和进展中起着关键作用。然而，PLK1在口腔癌细胞中的失调及其作用机制仍不清楚。
因此，本研究旨在探讨口腔癌细胞中PLK1的表达情况，并检查其在口腔癌细胞生长和增殖中的机制作用。同时，还研究了PLK1是否是紫锥菊素治疗口腔癌的有效靶点。本研究的结果将为开发一种针对PLK1及其下游成分的新药物提供新的见解。
部分摘录
化学品和试剂
本研究中使用的化学品和试剂由Himedia Laboratories Pvt. Ltd.提供，包括Triton X-100、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、溴化乙锭（EtBr）、4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和吖啶橙（AO）。罗丹明-123、氰基碳酰基-m-氯苯腙（CCCP）和二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA）购自美国Sigma-Aldrich公司。引物（β-actin、Bax、BCL2、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimentin和ZO1）由Integrated DNA Technologies (IDT)提供紫锥菊素靶基因的预测
分析11个口腔癌微阵列数据集后，筛选出|logFC|≥1且-值≤0.05的基因，共发现3286个上调基因，其中22个基因已在CTD数据库中被报道为紫锥菊素的靶点。排除这些基因后，继续分析剩余的3268个上调基因。使用Enricher对这些基因进行通路富集分析，发现110个上调基因富集在58个与肿瘤发生过程相关的统计显著通路中。
结论
总之，本研究揭示了PLK1与口腔癌之间的关联，并证实PLK1的过度表达促进了口腔癌的发生和不良预后。从UALCAN数据库中获得的数据表明，PLK1的表达增加与OSCC患者的生存率呈负相关。此外，研究发现PLK1是紫锥菊素的强大靶点，并与32个其他基因和9个枢纽基因相互作用。有趣的是，使用siPLK1敲低PLK1后
资金来源
本研究得到了印度新德里CSIR-UGC（Grant #997/CSIR-UGC NET JUNE 2019）的联合支持。作者贡献声明
斯图蒂·比斯瓦尔（Stuti Biswal）：撰写原始稿件、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。苏鲁蒂·比斯瓦尔（Sruti Biswal）：撰写、审稿与编辑、软件应用、数据分析。比贝卡南德·马利克（Bibekanand Mallick）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证。比杰什·K·比斯瓦尔（Bijesh K. Biswal）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验监督、数据分析、概念构建。未引用参考文献
[9], [10], [11], [18], [26], [30], [40], [41]利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。致谢
作者感谢印度奥里萨邦鲁尔凯拉国家技术学院提供的实验室和设备设施，以便进行研究。
