DHCR24基因敲低导致的细胞胆固醇缺乏会通过p38 MAPK/JNK信号通路，促使tau蛋白在Thr181、Ser199和Ser202/Thr205位点发生过度磷酸化

《Cellular Signalling》：DHCR24 knockdown-induced cellular cholesterol deficiency triggers tau hyperphosphorylation at Thr181, Ser199 and Ser202/Thr205 via p38 MAPK/JNK signaling

胆固醇缺乏与tau磷酸化的关系及其通过p38 MAPK/JNK通路的调控机制在SH-SY5Y细胞中得到验证，抑制剂可逆转效应，为AD治疗提供新靶点。

　　

张梦琪|魏文石|祖恒兵

复旦大学附属华东医院神经内科，中国上海200040

摘要

胆固醇缺乏与阿尔茨海默病（AD）的发病机制有关，但其对tau蛋白磷酸化的调控作用尚不清楚。我们研究了胆固醇生物合成中的关键酶24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）的缺失是否通过p38 MAPK和JNK信号通路导致SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中tau蛋白过度磷酸化。利用编码DHCR24-cDNA或DHCR24-shRNA的慢病毒载体，我们建立了稳定的DHCR24过表达和DHCR24敲低SH-SY5Y细胞模型。Filipin III染色和UPLC-MS/MS结果显示，DHCR24敲低显著降低了细胞内的胆固醇水平，而过表达则提高了胆固醇水平。免疫印迹显示，在DHCR24缺乏的情况下，tau蛋白在Thr181、Ser199和Ser202/Thr205位的磷酸化程度增加；总tau蛋白水平保持不变。同时，phospho-p38和phospho-JNK的水平增加了1.5至2.5倍，但总激酶水平没有变化，表明这些通路被激活。为了验证因果关系，我们将DHCR24沉默的细胞用不同剂量的p38抑制剂SB203580（0–40 μM）或JNK抑制剂SP600125（0–40 μM）进行处理。这两种化合物都能以剂量依赖的方式将tau蛋白磷酸化恢复到基线水平，最大抑制效果出现在40 μM（SB203580）和20–40 μM（SP600125）时。总体而言，这些数据表明DHCR24调控的胆固醇稳态是通过p38/JNK信号通路影响tau蛋白病理状态的分子调节器，并为AD的治疗提供了潜在靶点。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积和细胞内tau蛋白的过度磷酸化[1,2]。目前有几种药物可用于AD的治疗，但这些药物只能缓解症状，无法治愈或延缓疾病的进展，这凸显了需要更深入的机制研究和新的治疗策略。AD患者的tau蛋白在Thr181、Ser199、Thr231、Ser262、Ser396和Ser422等位点发生过度磷酸化[3]。随着时间的推移，过度磷酸化的tau蛋白会聚集形成不溶性的神经纤维缠结（NFTs），从而破坏微管结构，影响轴突运输，最终导致神经元功能障碍和死亡[4]。因此，阐明驱动tau蛋白过度磷酸化的机制对于开发有效的AD疗法至关重要。

越来越多的证据表明，大脑胆固醇代谢的紊乱与AD的发病机制有关[[5], [6], [7]]，但相关数据仍存在矛盾。一些荟萃分析显示血浆胆固醇水平与痴呆风险无关[8]，而另一些研究则描述了一种U形关系，即极低或极高的胆固醇水平都与风险增加相关[9,10]。这些差异可能反映了血脑屏障（BBB）对胆固醇从外周进入中枢神经系统的限制。在大脑内部，胆固醇稳态通过神经细胞内的从头合成和调节来维持[11]。星形胶质细胞产生的胆固醇是神经元膜的重要组成部分，可调节信号传导和突触功能[12]。然而，大脑胆固醇是否以及如何调节tau蛋白磷酸化仍是一个关键问题。

Greeve等人的神经病理学研究发现了一种新的神经保护基因——选择性阿尔茨海默病标志物-1（Seladin-1），该基因在AD患者的海马区和内嗅皮质神经元中表达下调[13]。Waterham随后证实Seladin-1编码24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24），这是一种在胆固醇生物合成最后一步催化脱麦角甾醇还原为胆固醇的酶[14]。值得注意的是，衰老与大脑胆固醇水平下降有关[15]，而实验性降低大脑胆固醇会干扰大脑发育和功能[16]。这些发现将DHCR24定位为胆固醇稳态与AD病理之间的潜在纽带。

在本研究中，我们系统地研究了DHCR24敲低引起的细胞胆固醇缺乏对tau蛋白磷酸化的影响。我们的发现揭示了大脑胆固醇代谢紊乱与tau蛋白病变之间的机制联系，为AD的发病机制提供了新的见解，并为治疗干预提供了理论基础。

实验方法片段

细胞培养

人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系由中国科学院（上海）提供，具有完整的STR谱型和无支原体认证。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）（Gibco，美国）的Dulbecco改良鹰培养基/F-12（DMEM/F-12）（KeyGEN Biotech，中国）中培养，培养条件为37°C，置于含5% CO?的湿润培养箱中。

慢病毒转染

慢病毒转染按照先前描述的方法进行[17]。

高效生成DHCR24缺乏和DHCR24过表达的SH-SY5Y细胞

为了研究DHCR24的功能作用，我们分别使用编码DHCR24-shRNA或DHCR24-cDNA的慢病毒载体建立了稳定的DHCR24敲低和DHCR24过表达SH-SY5Y细胞系。荧光显微镜检测显示，转染细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达强烈，慢病毒转染效率约为90%（图1A）。RT-qPCR和Western blot分析表明，LE组中的DHCR24 mRNA和蛋白水平降低了70%以上。

讨论

本研究建立了DHCR24缺乏、细胞胆固醇耗竭与阿尔茨海默病（AD）相关位点（Thr181、Ser199、Ser202/Thr205）tau蛋白过度磷酸化之间的新机制联系，这一过程通过激活p38 MAPK和JNK信号通路实现。通过结合生化、药理学和成像技术，我们证明了DHCR24沉默会导致膜胆固醇耗竭、脂质筏结构破坏，并通过p38 MAPK/JNK途径选择性地增加tau蛋白磷酸化。

作者贡献

M.Z. 进行实验、收集和分析数据，并撰写了初稿。W.W.和H.Z. 设计研究并监督整个研究过程。W.W.和H.Z. 审阅和编辑了手稿。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

作者贡献声明

张梦琪：撰写初稿、数据可视化、软件使用、方法设计、数据整理、概念构建。魏文石：撰写、审阅与编辑、监督、资金申请。祖恒兵：撰写、审阅与编辑、监督、资金申请。

资助

本研究得到了华东医院重点学科建设项目（资助编号：LCZX2207）和上海市金山 District重点医学基金会（资助编号：JSZK2019A06）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。