腺苷琥珀酸合成酶1缺失小鼠模型成功模拟ADSS1肌病特征

《Human Molecular Genetics》：Loss of adenylosuccinate synthetase 1 in mice recapitulates features of ADSS1 myopathy

本研究针对目前尚无有效治疗方案的超罕见ADSS1肌病，成功构建了首个组成型Adss1基因敲除小鼠模型。研究人员通过系统表征发现该模型虽表型相对温和，但重现了患者的关键病理特征，包括肌纤维内镶边空泡、异常糖原积累及收缩功能缺陷，并揭示了嘌呤核苷酸池减少但不影响ATP/ADP比值的独特代谢机制。该模型为深入探究疾病病理生理机制及开发靶向疗法提供了重要平台。

　　

在肌肉疾病的研究版图中，超罕见疾病往往因患者数量稀少而成为被忽视的角落，ADSS1肌病便是其中之一。这种由腺苷琥珀酸合成酶1（Adenylosuccinate synthetase 1, ADSS1）基因突变引起的常染色体隐性遗传病，以进行性心脏和骨骼肌变性为特征，患者通常在儿童至青少年时期发病，表现为肌无力、萎缩，严重者需依赖呼吸机支持。尽管其致病基因ADSS1已被鉴定，但由于全球已知患者不足200例，相关研究进展缓慢，目前仍无任何治愈方法或靶向治疗方案。ADSS1酶在嘌呤核苷酸循环中扮演着关键角色，该循环对维持肌肉细胞的能量代谢至关重要。酶功能缺失导致嘌呤核苷酸循环出现“瓶颈”，引发代谢功能障碍，最终造成进行性肌肉无力。因此，建立一个能够忠实模拟人类疾病特征的动物模型，成为揭开其发病机制、推动疗法开发的迫切需求。

以往的研究依赖于斑马鱼和线虫等非哺乳动物模型，但这些模型与人类的遗传及代谢相似性有限。例如，线虫仅有一个与人类ADSS1序列匹配度约50%的Adss基因，而小鼠Adss1基因与人类ADSS1的氨基酸同源性高达98%，这使得小鼠成为理想的人类疾病模拟者。在此背景下，由波士顿儿童医院Alan H. Beggs教授领导的研究团队在《Human Molecular Genetics》上发表了他们的最新成果，报道了首个ADSS1肌病的组成型小鼠模型，并对其进行了全面系统的表征。

研究人员为开展本研究应用了几个关键技术方法。他们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术删除了小鼠Adss1基因的第2个外显子，从而造成移码突变和翻译提前终止，构建了全身性Adss1基因敲除（Adss1^KO/KO）小鼠模型。利用蛋白质印迹法（Western blot）和实时定量PCR（RT-qPCR）技术在蛋白和mRNA水平上验证了基因敲除的成功。研究采用了包括自愿跑轮运动、四肢抓力测试和跑步机力竭实验在内的多种体内行为学分析来评估小鼠的运动功能。通过离体肌肉收缩力和疲劳度测量系统分析了趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌（Soleus）的收缩特性。使用超高效液相色谱（UPLC）技术精确测定了肌肉组织中多种核苷酸（如ATP、ADP、IMP）的浓度。最后，综合运用改良Gomori三色染色、NADH-TR染色、免疫荧光纤维分型、PAS染色以及透射电子显微镜（TEM）等多种组织病理学和超微结构技术，详细观察了肌肉的病理改变。

Adss1^KO/KO小鼠的生成与验证

研究团队通过基因编辑技术，将Adss1基因的第2个外显子两侧插入loxP位点，再与在卵母细胞中表达Cre重组酶的转基因小鼠交配，从而在全身所有组织中实现了Adss1基因的组成型敲除。

蛋白质印迹和RT-qPCR分析证实，与野生型（Adss1^WT/WT）相比，敲除鼠的骨骼肌和心肌中均检测不到AdSS1蛋白和Adss1 mRNA，而广泛表达的Adss2同工酶水平基本不变，成功实现了Adss1基因的功能失活。

Adss1^KO/KO小鼠存活且无体重缺陷，但表现出轻微运动功能障碍

Adss1^KO/KO小鼠按孟德尔比率出生，存活率正常，体重与野生型无显著差异，外观亦无法区分，直至一年龄时仍表现健康。为探测可能随年龄增长而显现的细微表型，研究人员对10-11月龄小鼠进行了功能评估。长期自愿跑轮活动监测发现，雌性Adss1^KO/KO小鼠的跑步距离与野生型相比出现显著差异，且从6-7月龄开始偏离；雄性小鼠的差异较小。然而，在6-7月龄时的抓力测试和11月龄时的跑步机力竭实验中，均未发现基因型间的显著差异。

Adss1^KO/KO小鼠离体肌肉表现出收缩缺陷

鉴于整体运动表型轻微，研究人员通过离体实验更精细地检测了肌肉功能。他们选取了代表小鼠肌肉代谢两种极端类型的趾长伸肌（EDL，几乎全为糖酵解快肌纤维）和比目鱼肌（Soleus，含大量慢氧化纤维）。尽管两种肌肉的重量无差异，但在超最大刺激下，3月龄和10月龄雄性Adss1^KO/KO小鼠的EDL产生的峰值收缩力显著低于野生型对照，比目鱼肌也有下降趋势但未达显著性。在低频率疲劳测试中，Adss1^KO/KO小鼠的EDL对重复低频率刺激的反应与野生型不同：其产生的相对力量初始阶段反而升高，提示可能存在肌肉松弛缺陷。这种差异未在比目鱼肌中观察到。

AdSS1缺失与总核苷酸池减少相关，但嘌呤稳态未发生严重失调

为探究Adss1敲除对骨骼肌能量代谢的影响，研究人员测量了静息和疲劳状态下肌肉中各种核苷酸的浓度。结果显示，Adss1^KO/KO小鼠肌肉中的总核苷酸浓度显著低于野生型。然而，反映可用自由能指标的ATP/ADP比值在两种基因型间基本保持不变，表明尽管核苷酸池缩小，肌肉能量学和嘌呤稳态并未因Adss1缺失而全面失调。与AdSS1酶功能障碍一致，其底物IMP（次黄嘌呤核苷酸）的浓度在静息的Adss1^KO/KO肌肉中显著高于野生型。在剧烈收缩导致腺嘌呤核苷酸降解后，两种基因型的肌肉中IMP浓度均上升，但Adss1^KO/KO肌肉因核苷酸池较小，疲劳后的IMP含量显著低于野生型。

AdSS1缺陷肌肉在组织学上显示明显的肌病特征

组织学分析揭示了Adss1^KO/KO小鼠与患者活检结果高度一致的肌病特征。对11月龄小鼠胫骨前肌（TA）的改良Gomori三色染色显示，敲除鼠肌纤维中出现镶边空泡、纤维分裂和内核等病理改变。其中，镶边空泡最为常见，且存在性别差异：11月龄雄性Adss1^KO/KO小鼠TA纤维中镶边空泡阳性率达12%，显著高于野生型（3%）；雌性敲除鼠为6%，也高于野生型。NADH-TR染色显示镶边空泡表现为氧化活性最低（淡紫色）纤维中的棕色焦点。免疫荧光纤维分型进一步证实，这些损伤主要集中于IIB型（糖酵解型）肌纤维中。

AdSS1缺陷肌肉表现出异常的糖原分布

PAS染色发现，Adss1^KO/KO小鼠肌肉纤维中有糖原成分（糖原、糖蛋白、糖脂）的积累。透射电镜（TEM）超微结构观察进一步证实，敲除鼠肌肉中，尤其在T管附近，存在明显的糖原沉积，这些致密的糖原聚集体位于肌肉兴奋-收缩耦联的关键部位附近。在糖原积累的区域，线粒体似乎变小或缺失。

研究结论与讨论

本研究成功开发并表征了首个ADSS1肌病的哺乳动物小鼠模型。尽管Adss1^KO/KO小鼠在无应激条件下总体健康，仅表现出轻微的运动功能缺陷，但它们成功地再现了人类疾病的多个关键方面：离体肌肉收缩力下降、独特的低频率疲劳反应、总核苷酸池缩小但ATP/ADP比值维持、以及特征性的组织病理学改变（如镶边空泡和异常糖原积累）。尤为重要的是，研究揭示了病理改变的纤维类型特异性，即糖酵解型（IIB型）纤维更易受损，这与其代谢特性（更高的腺嘌呤核苷酸水平和更强的疲劳倾向）相符，为理解疾病机制提供了新视角。

该模型的建立克服了以往非哺乳动物模型的局限性，为在遗传和代谢背景更接近人类的体系中深入研究ADSS1肌病的病理生理学提供了不可替代的工具。发现的糖原代谢异常提示，AdSS1缺陷虽主要影响嘌呤核苷酸代谢，但可能引发下游糖原处理的紊乱，这与糖原贮积病（如庞贝病）存在可能的共同病理机制。尽管Adss2同工酶可能提供一定的代谢补偿，但其具体机制及其在患者中是否失效仍需进一步探索。

总之，这项研究不仅为理解这种超罕见肌病的发病机制提供了重要见解，也为未来开发和测试潜在的治疗策略奠定了坚实的基础。该小鼠模型作为一个强大的临床前研究平台，将极大地推动针对ADSS1肌病的治疗探索。