在同时定量酮体、乳酸、丙酮酸和TCA循环中间体的过程中，需考虑的分析前因素

《Clinical Biomechanics》：Pre-analytical considerations in the simultaneous quantification of ketone bodies, lactate, pyruvate and TCA cycle intermediates

酮体、糖酵解及三羧酸循环中间代谢物的稳定性和准确性受抗凝剂及处理方式影响显著。本研究开发LC-MS/MS方法，系统评估锂肝素（LH）、EDTA、NaF/EDTA和NaCit抗凝剂在常温下对代谢物稳定性的影响，并比较LH血浆与酸沉淀全血（depWB）在不同温度下的稳定性。结果显示：LH血浆在4小时内代谢物稳定性最佳，NaF/EDTA对乳酸稳定但影响丙酮酸及三羧酸循环中间代谢物，而depWB虽适合乳酸/丙酮酸比值测定但稳定性较差。研究提出LH血浆适用于酮体及三羧酸循环代谢物分析，而NaF/EDTA和depWB各有适用场景，需根据检测目标优化样本处理流程。

　　这项研究探讨了在血液样本中准确量化小分子代谢物的重要性，特别是酮体（如β-羟基丁酸[BHB]和乙酰乙酸[AcAc]）、丙酮酸[Pyr]、乳酸[Lac]以及三羧酸循环（TCA）中间代谢物的关键因素。这些代谢物在细胞代谢中扮演着核心角色，不仅参与能量生成，还在多种调节过程中发挥作用。例如，丙酮酸和乳酸的比值可以反映细胞的氧化还原状态，而酮体比值则与线粒体功能密切相关。此外，TCA循环中间代谢物如琥珀酸[Suc]、柠檬酸[Cit]、苹果酸[Mal]等也与细胞信号传导、肿瘤发生和全身代谢效应有关。然而，这些代谢物在采集后容易受到化学不稳定性和快速代谢的影响，这给实验前的样本处理带来了挑战。

为了克服这些问题，研究人员开发了一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法，可以同时测定这些代谢物。他们系统地评估了不同抗凝剂（如肝素锂[LH]、乙二胺四乙酸[EDTA]、氟化钠/EDTA[NaF/EDTA]和柠檬酸钠[NaCit]）以及去蛋白化全血（depWB）对代谢物稳定性的影响。实验结果显示，不同的样本处理方式对代谢物的保存和浓度产生显著影响。例如，在室温下，全血中的丙酮酸和乳酸在采集后迅速变化，而使用NaF/EDTA的抗凝管可以有效稳定乳酸，但会显著降低丙酮酸的浓度，从而影响丙酮酸/乳酸比值的准确性。另一方面，去蛋白化全血虽然能更好地保持丙酮酸/乳酸比值的稳定性，但会导致TCA循环中间代谢物的浓度变化更大，尤其是在不同的储存温度下。

研究还发现，某些抗凝剂如柠檬酸钠在样本处理过程中引入了意想不到的代谢变化。例如，在柠檬酸钠抗凝的全血样本中，乙酰乙酸的浓度反而升高，而琥珀酸和苹果酸也出现了显著的变化。这些结果表明，抗凝剂不仅影响代谢物的稳定性，还可能改变其绝对浓度，因此在选择样本处理方式时需要特别谨慎。此外，研究还指出，尽管去蛋白化全血能够迅速抑制酶活性，但其处理过程中的复杂性限制了其在常规临床环境中的应用。相比之下，肝素锂抗凝的血浆在快速离心后表现出较好的代谢物稳定性，尤其适合用于酮体和TCA循环中间代谢物的测定。

研究进一步分析了不同样本处理条件对代谢物浓度的影响。结果显示，大多数代谢物在去蛋白化全血中的浓度低于血浆，这可能与细胞内代谢物的分布和抗凝剂的稳定作用有关。而苹果酸在去蛋白化全血中的浓度却显著高于血浆，这提示了其可能在细胞外有更高的积累。此外，某些代谢物如琥珀酸和苹果酸在酸化条件下表现出较高的分析变异性，这可能是由于质谱检测过程中基质效应或非酶促降解所致。

综合来看，研究强调了样本处理方式对代谢物稳定性和浓度的影响。肝素锂抗凝的血浆在快速离心后能够提供较为可靠的代谢物浓度，适合用于酮体和TCA循环中间代谢物的测定。然而，对于丙酮酸/乳酸比值的准确测定，去蛋白化全血仍然是更优的选择，尽管其分析变异性相对较高。柠檬酸钠抗凝的样本则显示出复杂且不可预测的代谢变化，这需要进一步的机制研究来解释其作用。研究还指出，样本处理协议应根据具体的代谢目标进行调整，并结合适当的参考值以确保结果的准确性和可解释性。

此外，研究提到，这些代谢物在临床中的应用已有较长的历史，但在实验前的处理环节仍存在许多未被充分理解或标准化的问题。例如，抗凝剂类型、储存温度和时间以及是否使用全血或血浆样本都会对代谢物的稳定性和浓度产生影响。因此，为了确保代谢物检测结果的可靠性，需要建立统一的样本处理流程，并充分考虑这些因素。实验结果还表明，在不同的储存条件下，代谢物的稳定性存在显著差异，特别是在室温下，某些代谢物如丙酮酸和乙酰乙酸会迅速降解，而其他如β-羟基丁酸和柠檬酸则表现出较好的稳定性。

研究还探讨了不同抗凝剂对代谢物浓度的具体影响。例如，NaF/EDTA抗凝的样本中，丙酮酸的浓度显著降低，这可能是由于氟化物对糖酵解过程的抑制作用。而柠檬酸钠抗凝的样本中，乙酰乙酸的浓度反而升高，这可能与柠檬酸钠在血液中的作用机制有关。这些发现表明，抗凝剂不仅影响代谢物的稳定性，还可能改变其绝对浓度，因此在选择抗凝剂时需要权衡其对不同代谢物的影响。

总体而言，这项研究为临床和代谢研究中的样本处理提供了重要的参考。它揭示了不同抗凝剂和处理条件对代谢物稳定性的影响，并强调了在选择样本处理方式时需考虑代谢物的特性和实验目的。研究结果表明，肝素锂抗凝的血浆在快速离心后能提供较为可靠的代谢物浓度，而去蛋白化全血则更适合丙酮酸/乳酸比值的测定。柠檬酸钠抗凝的样本虽然在某些情况下表现出较好的稳定性，但其复杂的代谢变化需要进一步研究。因此，研究人员建议在实际应用中，根据具体的代谢目标选择合适的样本处理方式，并结合适当的参考值以确保检测结果的准确性和可解释性。此外，研究还指出，样本处理协议应根据实验的具体需求进行调整，以最大限度地减少实验前的代谢变化，提高检测的可靠性和临床实用性。