在以羧甲基赖氨酸为驱动因素的视网膜共培养模型中发现的FBXW7基因高甲基化现象：一种具有糖尿病视网膜病变诊断潜力的表观遗传生物标志物

《Computers in Biology and Medicine》：Novel FBXW7 hypermethylation in a carboxymethyl lysine- driven retinal co-culture model: An epigenetic biomarker with translational potential for diabetic retinopathy

糖尿病视网膜病变（DR）与AGEs相关表观遗传修饰的研究。通过共培养模型分析CML对视网膜内皮细胞（HREC）和周细胞（HRP）DNA甲基化的影响，发现FBXW7显著高甲基化，SF3B1和DIXDC1低甲基化，TP53作为关键信号 hub。验证FBXW7在血清中的低表达与DR患者相关，提示其为表观遗传生物标志物和潜在治疗靶点。

　　糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是一种常见的糖尿病微血管并发症，是全球范围内导致视力丧失的主要原因之一。随着糖尿病患病率的上升，DR的临床研究和防治手段变得尤为重要。近年来，研究发现，糖尿病环境中高血糖水平会引发一系列代谢异常，从而导致多种病理变化，包括血管内皮功能障碍、血管通透性增加以及视网膜水肿和缺血等。这些变化最终可能引发不可逆的视力损害。因此，理解DR的分子机制对于开发有效的治疗策略具有重要意义。

在DR的发病机制中，晚期糖基化终产物（Advanced Glycation End Products, AGEs）被认为是关键的致病因子之一。AGEs是在高血糖环境下通过非酶促糖基化反应形成的，它们不仅可以直接损伤细胞结构，还可能通过影响表观遗传调控，间接参与疾病的发展。其中，Nε-(Carboxymethyl) lysine（CML）是AGEs中最主要的代表之一，在DR患者的视网膜组织中大量积累。CML的形成与氧化应激、炎症反应和血管损伤密切相关，这些因素共同作用，导致视网膜微血管系统的功能紊乱。

为了更深入地探讨CML对表观遗传调控的影响，本研究采用了一种共培养模型，分析了CML暴露后人视网膜内皮细胞（Human Retinal Endothelial Cells, HREC）和人视网膜周细胞（Human Retinal Pericytes, HRP）的DNA甲基化图谱。这种共培养模型能够模拟糖尿病微环境中两种关键细胞类型的相互作用，为研究DR的复杂病理过程提供了重要的实验平台。实验中，HREC和HRP在正常血糖条件下（5.5 mM葡萄糖）被暴露于3.81 nM的CML，并在24小时后进行DNA甲基化分析。研究使用了Illumina Infinium Human Methylation 935K EPIC BeadChip平台，这是一种高通量DNA甲基化检测工具，能够覆盖大约935,000个CpG位点和453个非CpG位点，具有广泛的基因组覆盖能力。该平台能够检测基因启动子区域、5'非翻译区（5' UTRs）、第一外显子、基因体以及3'非翻译区（3' UTRs）等关键调控区域，从而提供全面的甲基化信息。

通过比较分析，研究发现了7个在HREC和HRP中共同表现出显著高甲基化的基因，以及5个共同表现出显著低甲基化的基因。其中，FBXW7基因的甲基化程度显著增加（Diff Score +13），而SF3B1和DIXDC1基因则表现出显著的低甲基化（Diff Score ?13）。这些结果提示，CML可能通过改变特定基因的甲基化状态，影响其表达水平，从而参与DR的发病过程。进一步的蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，TP53基因在这些高甲基化基因中扮演了中心枢纽的角色，这表明CML可能通过影响TP53的调控网络，进而影响细胞的凋亡、增殖和修复等关键功能。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，它通过在DNA分子上的胞嘧啶残基添加甲基基团，调控基因的表达。DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）是这一过程的关键酶，它们能够催化甲基基团的转移，从而影响基因的活性。研究发现，高血糖条件下的长期暴露会导致DNA甲基化模式的改变，这可能与DR的发展密切相关。此外，代谢记忆现象（Metabolic Memory）是指即使血糖水平恢复正常，高血糖引起的表观遗传变化仍可能持续存在，这进一步表明了DNA甲基化在DR中的重要性。

本研究不仅揭示了CML对DNA甲基化的影响，还通过定量聚合酶链反应（qPCR）验证了关键基因的表达变化。结果显示，FBXW7基因的表达水平在糖尿病性视网膜病变（PDR）患者的血清中显著降低（8.169 ± 1.25, n=21, p值<0.033），这一发现进一步支持了CML在DR中作为表观遗传标志物的潜力。FBXW7基因在细胞周期调控和肿瘤抑制中具有重要作用，其表达水平的降低可能与DR中内皮细胞的功能紊乱有关。

研究还发现，CML暴露导致的DNA甲基化变化具有一定的组织特异性。CpG岛的映射分析显示，不同基因区域的甲基化水平存在显著的异质性，这表明CML可能通过靶向特定的CpG岛，影响相关基因的表达。这种组织特异性的甲基化变化，可能与DR中不同细胞类型的功能改变有关，也为未来的个性化治疗策略提供了新的思路。

在讨论部分，研究指出，尽管本研究揭示了CML对DNA甲基化的影响，但仍然存在一定的局限性。例如，研究主要集中在FBXW7基因的表达水平，而对其表观遗传调控机制的探讨仍显不足。此外，本研究尚未进行基于循环DNA（cfDNA）的定量甲基化特异性PCR（qMSP）分析，这可能限制了对CML在实际临床样本中的作用的理解。未来的研究可以进一步结合多种表观遗传分析方法，如染色质免疫沉淀（ChIP）、RNA测序（RNA-seq）和表观基因组编辑技术，以更全面地揭示CML对DR的影响机制。

在结论部分，研究强调了AGEs在DR中的核心作用，并指出表观遗传调控在调节AGE响应信号通路中的重要性。通过使用Illumina 935K BeadChip平台，本研究不仅鉴定了918个差异甲基化的基因，还发现了超过937,000个甲基化CpG探针，这些结果为理解DR的表观遗传基础提供了重要的数据支持。同时，研究还指出，这些差异甲基化基因可能涉及多种重叠的生物学过程，包括细胞凋亡、炎症反应和血管生成等，这些过程共同参与了DR的病理发展。

本研究的伦理声明表明，所有实验均在符合相关法律法规和机构伦理委员会审批的前提下进行。研究共纳入63名年龄在35至85岁之间的患者，他们接受了白内障和玻璃体切除手术。这些患者的数据为研究提供了宝贵的临床背景，同时也确保了实验的伦理合规性。

研究的资金支持来自印度科学与工业研究委员会（DST-SERB）的CRG/2021/002607项目，项目周期为2022年至2025年。这种资金支持确保了研究的系统性和可持续性，同时也为未来进一步深入探索DR的表观遗传机制奠定了基础。

在利益冲突声明中，研究作者确认他们没有已知的财务或人际利益冲突，这表明研究结果的客观性和可靠性。此外，研究还指出，尽管本研究在实验设计和数据分析方面具有较高的严谨性，但在实际应用中仍需进一步验证。例如，CML作为表观遗传标志物的潜力，可以通过在特定生物样本（如泪液）中的检测来进一步确认。这种检测方法的开发，可能为DR的早期诊断和干预提供新的工具。

综上所述，本研究通过分析CML暴露下HREC和HRP的DNA甲基化图谱，揭示了AGEs在DR中的表观遗传调控作用。研究结果不仅加深了对DR发病机制的理解，也为未来的诊断和治疗策略提供了新的方向。通过高通量DNA甲基化分析，研究人员能够更全面地探索表观遗传变化与DR病理过程之间的关系，为糖尿病相关眼病的研究做出了重要贡献。