大肠杆菌铁硫簇生物合成与铁稳态调控新机制：[2Fe-2S]簇激活的Fur转录因子

《Metallomics》：Iron-sulfur cluster biogenesis and regulation of intracellular iron homeostasis in Escherichia coli

本研究针对长期以来关于细菌铁摄取调节蛋白(Fur)如何感知细胞内自由铁这一核心问题，通过系统实验揭示，在大肠杆菌中，Fur并非如传统认为的结合Fe(II)，而是在铁硫簇组装 machinery 作用下结合一个[2Fe-2S]簇，从而成为活性阻遏蛋白来调控细胞内铁稳态。该发现不仅修正了长达四十余年的Fur作用模型，更将铁硫簇生物合成与铁稳态调控这两个关键生理过程直接联系起来，为理解细菌应对铁胁迫的分子机制提供了全新视角。

　　

铁，这个对几乎所有生命体都至关重要的金属元素，在细胞内部却扮演着“双刃剑”的角色。一方面，它是众多蛋白质执行功能所必需的辅因子，尤其是一大类被称为铁硫蛋白的蛋白质，它们依靠铁硫簇来参与从能量代谢到DNA复制修复等多种核心生命活动。在大肠杆菌中，至少有144种注释的铁硫蛋白，占其蛋白质组的3%以上。另一方面，过量的自由铁，特别是亚铁离子(Fe²⁺)，会通过芬顿反应产生活性氧物种，对细胞组分造成严重的氧化损伤。因此，细胞必须精密调控其内部的自由铁浓度，使其既能满足铁硫簇生物合成的需求，又不会引发氧化应激。自1970年代末被发现以来，科学界普遍认为，细菌中的铁摄取调节蛋白(Ferric Uptake Regulator, Fur)通过结合Fe(II)作为辅阻遏物来发挥功能，调控包括铁转运、储存、氧化应激反应乃至细菌毒力在内的上百个基因的表达。然而，一个令人困惑的谜团始终存在：这个假说中的“铁结合”形式的Fur蛋白，从未在埃希氏菌属或其他任何细菌的体内被直接鉴定到。

这项发表在《Metallomics》上的研究，正是为了解开这个长达四十多年的谜题。研究人员开展了一系列主题明确的研究，最终得出了颠覆性的结论：在大肠杆菌中，Fur蛋白并非结合单个铁原子，而是在响应细胞内自由铁含量升高时，结合一个由铁硫簇组装机器酶促合成的[2Fe-2S]簇，从而转变为具有DNA结合活性的转录阻遏蛋白。这一发现不仅修正了传统的Fur激活模型，更重要的是，它揭示了铁硫簇生物合成与细胞内铁稳态调控之间存在一种前所未有的直接分子联系，Fur蛋白本身成为了连接这两个核心生理过程的桥梁。

为开展此项研究，作者团队主要运用了几项关键技术方法：利用分子生物学技术构建了多种大肠杆菌基因敲除株（如ΔiscA/ΔsufA, ΔiscU）；通过蛋白质纯化技术从不同培养条件下（如LB培养基、M9培养基添加不同浓度铁）的细菌中分离目的蛋白（Fur, IscA, IscS等）；采用紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、电子顺磁共振(EPR)和穆斯堡尔谱(M?ssbauer spectroscopy)等多种生物物理技术对纯化蛋白的金属辅基进行定性和定量分析；通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)精确测定蛋白的金属含量；并利用凝胶阻滞迁移实验(EMSA)和限制性内切酶保护实验等体外生化分析评估蛋白与DNA（Fur-box）的结合活性。

2. Iron-sulfur cluster biogenesis and intracellular free iron content in E. coli.

2.1. Iron-sulfur cluster biogenesis and IscA.

研究首先聚焦于铁硫簇的生物合成。在大肠杆菌中，看家基因簇iscSUA-hscBA-fdx编码六个核心组装蛋白。其中，IscA被认为是一种A型载体蛋白。研究发现，IscA不仅能够结合[2Fe-2S]簇，更具有独特的、强大的单核铁结合能力。当缺失IscA及其旁系同源蛋白SufA时，会特异性抑制[4Fe-4S]簇而非[2Fe-2S]簇在靶蛋白中的组装，且这种现象仅在好氧条件下出现，提示IscA/SufA可能在好氧条件下作为铁伴侣，为[4Fe-4S]簇的组装提供铁源。

2.2. A distinct iron binding activity of E. coli IscA.

进一步的实验证实，从大肠杆菌中纯化的IscA含有显著的单核铁，其紫外吸收光谱在315 nm处有特征峰，EPR谱图显示其结合了一个高自旋S=3/2的Fe(III)中心。IscA与Fe(II)的解离常数高达3.0×10¹⁹ M^-1，表明其具有很强的铁结合能力。在好氧条件下，IscA能稳定结合Fe(II)并将其提供给铁硫簇的组装过程，支持了其作为铁伴侣的假说。

2.3. Deletion of IscA/SufA results in accumulation of the persulfide-bound IscS in E. coli cells under aerobic growth conditions.

为了探究IscA的生理功能，研究人员发现在ΔiscA/ΔsufA突变株中，半胱氨酸脱硫酶IscS会积累过硫化物而呈现红色，活性降低。同样，在野生型菌株中使用铁螯合剂2,2‘-联吡啶耗尽细胞内自由铁，也会导致相同的红色IscS积累。这一结果将IscA/SufA的缺失与细胞内铁供应受阻联系起来，为IscA作为铁伴侣的观点提供了有力的体内证据。基于此，研究提出了一个好氧条件下[4Fe-4S]簇组装的模型：IscS提供硫，IscA招募铁，二者协同作用于支架蛋白IscU进行簇的组装，随后由IscA、ErpA、NfuA等载体将组装好的簇传递给靶蛋白。

2.4. Deletion of IscA and SufA elevates intracellular“free” iron content in E. coli.

根据IscA作为铁伴侣的假设，其缺失应导致细胞内自由铁积累。实验证实，ΔiscA/ΔsufA突变株确实表现出细胞内自由铁含量的显著升高，这为后续研究Fur蛋白的激活创造了条件。

3. The ferric uptake regulator(Fur) binds a[2Fe-2S] cluster in response to elevation of intracellular free iron content in E. coli.

3.1. The ferric uptake regulator(Fur) regulates intracellular iron homeostasis.

Fur是一个全局转录因子，通过结合靶基因启动子区的Fur-box序列来调控超过150个基因的表达，其调控机制复杂，包括直接阻遏、间接通过小RNA RyhB调控等。

3.2. The current model for the regulation of intracellular iron homeostasis by Fur.

尽管传统模型认为Fur结合Fe(II)后激活，但体外测得的Fur对Fe(II)的亲和力（解离常数10-85 μM）远低于细胞内极低的自由铁浓度（<1 μM），这使得Fur在体内结合Fe(II)的可能性极低。以往在体外厌氧条件下用过量Fe(II)重构得到的“Fe(II)-Fur”可能并非其生理相关形式。

3.3. E. coli Fur binds a[2Fe-2S] cluster in the E. coli mutant cells with deletion of IscA and SufA.

利用ΔiscA/ΔsufA突变株细胞内自由铁升高的特点，研究人员在该菌株中表达并纯化Fur蛋白，发现其呈亮红色。光谱学分析（UV-Vis, EPR, M?ssbauer） unequivocally 表明，该红色蛋白结合了一个[角和边距]2Fe-2S[/角和边距]簇，而非单核铁。即使在野生型菌株中，也有约8%的Fur结合了[2Fe-2S]簇，而突变株中这一比例升至约36%，证明[2Fe-2S]簇的结合是Fur在体内的真实状态，且其结合水平响应细胞内铁含量。

3.4. Fur progressively binds a[2Fe-2S] cluster in the wild-type E. coli grown in M9 medium supplemented with increasing concentrations of iron.

在成分明确的M9培养基中，随着铁补充浓度的增加（0至10 μM），Fur蛋白中[2Fe-2S]簇的占有率呈现剂量依赖性升高，在1.0 μM铁时达到约36%的平台期。全细胞穆斯堡尔谱和ICP-MS分析进一步确认，在体内条件下，Fur结合的是氧化态[2Fe-2S]簇，且未检测到结合Zn(II)或单核Fe(II)。

3.5. Fur becomes an active repressor upon the binding of a[2Fe-2S] cluster.

功能实验表明，结合了[2Fe-2S]簇的“红色Fur”在凝胶阻滞迁移实验和限制性内切酶保护实验中均能有效结合Fur-box DNA序列，而缺乏金属的apo-Fur则无此活性，证明[2Fe-2S]簇的结合是Fur作为转录阻遏蛋白激活的关键。

3.6. Fur binds a[2Fe-2S] cluster to form a homodimer via the conserved cysteine residues at the C-terminus.

通过点突变和结构域分析，研究确定[2Fe-2S]簇结合在Fur蛋白的位点3（Site 3），由Cys-93和Cys-96等保守半胱氨酸残基配位。该位点也是此前报道的Zn(II)结合位点。[2Fe-2S]簇或Zn(II)的结合均能促使Fur形成同源二聚体。在LB培养基（富含Zn(II)）中，Fur可能更多被Zn(II)占据位点3，从而干扰其铁感应功能；而在Zn(II)含量低的M9培养基中，Fur能更有效地通过结合[2Fe-2S]簇来响应铁信号。

3.7. E. coli Fur is a new member of the transcription factor family that binds an iron-sulfur cluster.

该发现使Fur加入了利用铁硫簇作为感应器的转录因子家族，如哺乳动物的IRP-1（结合[4Fe-4S]簇）、酵母的Yap5/Aft2（结合[2Fe-2S]簇），以及大肠杆菌中已知的FNR（[4Fe-4S]簇，感应氧）、IscR（[2Fe-2S]簇，感应铁硫簇组装状态）和SoxR（[2Fe-2S]簇，感应氧化应激）等。

4. Iron-sulfur cluster biogenesis and regulation of Fur in E. coli.

4.1. The[2Fe-2S] cluster in Fur is assembled by the iron-sulfur cluster assembly machinery.

Fur蛋白中[2Fe-2S]簇的组装依赖于铁硫簇组装机器。研究发现，缺失支架蛋白IscU会严重阻碍Fur中[2Fe-2S]簇的组装，表明该过程是酶促的，而非简单的热力学结合，这确保了Fur能够快速感应细胞内铁浓度的波动。

4.2. Gene fur expression is regulated by the iron-sulfur cluster biogenesis.

fur基因的表达本身也受到铁硫簇生物合成的调控。例如，其表达受另一个铁硫簇蛋白SoxR（通过SoxS）的激活。同时，Fur蛋白自身也通过调控RyhB来影响其mRNA的翻译稳定性，形成一个反馈环路。

4.3. Fur regulates the expression of the iron-sulfur cluster assembly proteins.

作为全局调控因子，Fur也反向调控铁硫簇组装系统的表达。它直接阻遏应激诱导型sufABCDSE操纵子的转录。同时，活性Fur通过抑制小RNA RyhB的表达，间接稳定看家型iscSUA操纵子的mRNA，从而促进其表达。这样，当细胞内铁充足时，Fur被[2Fe-2S]簇激活，一方面抑制非必需的suf系统，另一方面促进isc系统的铁硫簇组装活性，实现精细调控。

5. Summary

研究最终总结并提出一个全新的、互联的调控模型：在大肠杆菌中，细胞内自由铁被IscA等铁伴侣动员用于铁硫簇生物合成。当自由铁水平升高时，全局铁调节蛋白Fur通过iscSUA-hscBA-fdx系统组装一个[2Fe-2S]簇，从而被激活。激活的Fur进而通过抑制RyhB（间接促进isc表达）和直接阻遏suf表达，来优化铁硫簇的生物合成，防止铁过载导致的氧化损伤。反之，当铁稀缺时，Fur失去[2Fe-2S]簇，失活，解除了对suf系统的抑制并允许RyhB高表达以降解iscSUA mRNA，从而在低铁条件下维持铁硫簇组装，同时避免产生过多自由铁。因此，Fur蛋白是连接铁硫簇生物合成和细胞内铁稳态调控的关键节点。

这项研究的重要意义在于，它从根本上更新了对原核生物铁稳态核心调控蛋白Fur的认识，从“Fe(II)传感器”转变为“[2Fe-2S]簇传感器”，揭示了铁硫簇生物合成机器在金属传感转录因子激活中的直接作用。这不仅为理解细菌适应铁环境变化的机制提供了新范式，也可能为针对细菌铁代谢途径开发新的抗菌策略提供新的思路。