柑橘专一性害虫橘小实蝇高质量染色体级别基因组解析：嗅觉适应与寄主专一性的分子机制

《GigaScience》：A high-quality chromosome-level genome assembly of the oligophagous fruit fly Bactrocera tsuneonis (Diptera: Tephritidae) and insights into its host specificity

本研究针对柑橘重要害虫橘小实蝇(Bactrocera tsuneonis)的寄主专一性机制不明问题，通过PacBio HiFi和Hi-C技术完成了首个染色体级别基因组组装(339 Mb)，发现其化学感受基因家族(OBPs/ORs)显著收缩，功能实验证实BtsuOBP83a特异性结合柑橘挥发物trans-nerolidol和piperitone，分子对接与动力学模拟揭示BtsuOr7a-6/7a-4为关键气味受体。该研究为寡食性昆虫的嗅觉适应机制提供了理论依据，为基于行为调控的害虫治理策略开发靶点。

　　

在柑橘种植业中，一种名为橘小实蝇(Bactrocera tsuneonis)的昆虫正悄然造成严重的经济损失。这种害虫具有高度专一的食性，几乎只危害柑橘类水果，其雌虫会用产卵器刺穿未成熟的柑橘果实进行产卵，幼虫则在果实内部取食，导致果实腐烂和脱落。据统计，橘小实蝇每年可造成10%-20%的柑橘产量损失，若不加以控制，损失甚至可能超过50%。随着柑橘成为全球种植最广泛的水果之一，这种被列为国际检疫性害虫的昆虫已引起全球关注。

然而，尽管橘小实蝇具有重要的经济意义，科学家们对其寄主专一性的遗传基础了解甚少。为什么橘小实蝇如此"钟情"于柑橘？其嗅觉系统如何精准识别柑橘挥发物？这些问题的答案对于开发新型防控策略至关重要。随着基因组学技术的快速发展，高质量基因组组装为解析这些科学问题提供了前所未有的机会。在此背景下，中国农业大学的研究团队在《GigaScience》上发表了关于橘小实蝇染色体级别基因组的研究，揭开了这一专一性害虫的分子适应机制。

研究人员采用PacBio高保真(HiFi)测序和Hi-C(高通量染色体构象捕获)技术相结合的策略，对橘小实蝇进行了全基因组测序。通过Illumina短读长测序进行基因组调查，利用PacBio HiFi长读长数据进行初步组装，再结合Hi-C数据将contig锚定到染色体水平。基因注释采用从头预测、同源预测和转录组证据相结合的方法，并通过比较基因组学分析探讨了化学感受基因家族的进化特征。功能研究方面，团队通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析柑橘挥发物，采用原核表达系统获得重组气味结合蛋白(OBP)，利用荧光竞争结合实验筛选配体，结合AlphaFold2结构预测、分子对接和分子动力学模拟(MD)揭示了关键嗅觉蛋白与挥发物的相互作用机制。

基因组测序与组装

研究人员成功获得了24.91 Gb的Illumina短读长数据、37.82 Gb的PacBio HiFi长读长数据和58.88 Gb的Hi-C数据。基于k-mer(k=19)分析估计橘小实蝇基因组大小约为324 Mb，杂合率为1.61%，重复序列含量为15.1%。

最终组装获得的基因组大小为339 Mb，包含75个contig，contig N50达到11.21 Mb。这一基因组大小小于其他实蝇物种，如橘小实蝇(530.3 Mb)、瓜实蝇(702.7 Mb)等，但略大于蜜柑大实蝇(325.3 Mb)。通过Hi-C辅助组装，研究人员成功将98.55%的序列锚定到6条染色体上，scaffold N50达到59.93 Mb，染色体长度范围在14.95-78.77 Mb之间。BUSCO(基准通用单拷贝同源基因)评估显示基因组完整性达99.2%，证实了组装的高质量。

基因组注释

橘小实蝇基因组中重复序列比例为24.17%，低于大多数其他实蝇物种。其中，长散在重复序列(LINE)占1.82%，长末端重复序列(LTR)占1.63%，DNA转座子占4.63%。研究人员共预测到14,529个蛋白质编码基因，其中13,513个(93.01%)成功获得功能注释。与其它实蝇相比，橘小实蝇的基因数量相对较少，这可能与其特化的生物学特性相关。

染色体共线性分析

通过与其他实蝇物种进行共线性比较发现，橘小实蝇与橘小实蝇之间存在高度的基因同线性关系。特别值得注意的是，橘小实蝇的Chr02与橘小实蝇的Chr04以及黑腹果蝇的X染色体均显示共线性，表明这些染色体可能是性染色体。综合分析表明，橘小实蝇可能具有5条常染色体和1条X染色体(5+X)的核型。

直系同源基因预测与系统发育关系推断

研究人员选取了17种昆虫进行直系同源基因分析，包括橘小实蝇、蜜柑大实蝇、黑腹果蝇以及其他14种实蝇科物种。OrthoFinder分析将367,296个基因聚类为33,010个独特的基因家族。基于单拷贝直系同源基因构建的系统发育树显示，所有实蝇物种形成一个独立的分支。分化时间估算表明，橘小实蝇与蜜柑大实蝇的分化时间约为430万年前，而实蝇属与黄瓜实蝇属的分化时间约为5930万年前。

与适应性和入侵性相关的基因家族

CAFE分析显示，橘小实蝇在进化过程中有559个基因家族发生扩张，1,166个基因家族发生收缩。功能注释表明，化学感受相关基因(OR、OBP、GR)主要出现在收缩的基因家族中，而与解毒代谢相关的基因(CYP450、ABC)则在扩张的基因家族中富集。研究人员进一步注释了多个与环境适应性相关的基因家族，包括化学感受相关基因(OBP、OR、IR、GR、CSP)、热休克蛋白(HSP)以及解毒相关基因(ABC、GST、P450、UGT、CCE)。

具体而言，在橘小实蝇基因组中鉴定到119个CYP450(细胞色素P450单加氧酶)、65个ABC(ATP结合盒转运蛋白)、30个UGT(UDP-葡萄糖醛酸转移酶)、40个GST(谷胱甘肽S-转移酶)和7个CCE(羧酸/胆碱酯酶)。热休克蛋白家族包含91个基因，分为5个亚家族：19个HSP20、41个HSP40、10个HSP60、18个HSP70和3个HSP90。与其它实蝇相比，橘小实蝇的HSP基因数量较多，这可能与其环境适应能力相关。

化学感受系统相关基因

昆虫化学感受相关基因家族包括OBP、GR(味觉受体)、OR、IR(离子型受体)、CSP(化学感受蛋白)和SNMP(感觉神经元膜蛋白)。在橘小实蝇基因组中，共鉴定出39个OBP、68个OR、79个IR、62个GR、7个CSP和14个SNMP。与多食性实蝇相比，橘小实蝇的OBP、OR、GR和CSP基因数量显著减少，而IR和SNMP基因数量相对稳定。

系统发育分析显示，寡食性的橘小实蝇的OBP基因数量明显少于多食性的瓜实蝇。同样，OR基因家族也发生了大规模收缩，特别是在OR-VI和OR-VII组中，OR7a和OR59a等基因在橘小实蝇中特异性收缩。这些发现表明，橘小实蝇在关键化学感受基因家族中经历了选择性基因丢失，这可能影响了其寄主植物专一性和生态适应。

不同组织的转录组

通过对不同组织部位进行转录组测序，研究人员获得了55.37 Gb的clean reads用于组织特异性表达分析。BtsuOBP在成虫不同部位的表达热图显示，大多数BtsuOBP呈现广泛的表达模式，其中13个BtsuOBP在触角中表达较高，5个在产卵器中表达较高。值得注意的是，BtsuOBP83a和BtsuOBP83b在触角中的表达水平最高，表明它们在嗅觉感知中起关键作用。

类似地，BtsuOR的转录组分析显示，大多数BtsuOR主要在触角中表达，仅有少数在足或产卵器中检测到。通过qRT-PCR对5个OBP基因和5个OR基因进行验证，结果与转录组数据高度一致，证实了RNA测序为基础的基因表达谱的可靠性。

BtsuOBP的配体结合特性

通过GC-MS分析柑橘挥发物，研究人员从茂谷柑中鉴定出10种主要挥发物，并结合非寄主植物的33种挥发物，共筛选43种化合物作为潜在配体进行研究。BtsuOBP83a和BtsuOBP83b成功在原核系统中表达，纯化后通过荧光竞争结合实验评估其结合特性。

实验结果显示，BtsuOBP83a对1-NPN(N-苯基-1-萘胺)的解离常数(K_d)为5.48μM，BtsuOBP83b为6.92μM。在43种测试挥发物中，BtsuOBP83a对两种寄主来源的挥发物(trans-nerolidol和piperitone)表现出特异性结合 affinity，而对非寄主来源的挥发物结合较弱。相比之下，BtsuOBP83b对所有测试化合物的结合均较弱。这些发现表明BtsuOBP83a可能在橘小实蝇的寄主挥发物识别中起关键作用。

结构预测与分子对接

利用AlphaFold 2.0预测了BtsuOBP83a的三维结构，该结构显示出六个典型的α螺旋和一个疏水结合腔，符合昆虫气味结合蛋白的典型特征。分子对接结果显示，BtsuOBP83a具有一个能够与trans-nerolidol和piperitone相互作用的结合腔，主要通过疏水相互作用和氢键结合。

对于trans-nerolidol，其结合通过与PHE22、LEU58、ILE62、LEU76、VAL84、LEU88、TRP114、PHE123和PRO125等残基的疏水相互作用实现，同时与PHE123形成氢键。Piperitone则与LEU76、LEU88、TRP114、TYR122和PHE123等残基发生疏水相互作用。分子对接得到的结合自由能分别为trans-nerolidol(-6.71 kcal/mol)和piperitone(-6.317 kcal/mol)，表明BtsuOBP83a与这些配体之间存在强相互作用。

为了进一步探究挥发物与气味受体的相互作用，研究人员利用AlphaFold2预测了OR-ORco(气味受体共受体)异源复合物的结构。分子对接分析发现，在68个OR中，BtsuOr7a-6与trans-nerolidol的结合能最低(-7.381 kcal/mol)，而BtsuOr7a-4与piperitone的亲和力最强(-6.904 kcal/mol)。

分子动力学模拟

通过分子动力学模拟进一步评估了BtsuOr7a-6和BtsuOr7a-4与相应配体结合的稳定性。trans-nerolidol与BtsuOr7a-6的相互作用表现出显著的稳定性和特异性，蛋白质结构在40 ns后趋于稳定，配体RMSD(均方根偏差)保持在约0.1 nm。MM/PBSA(分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积)计算估计结合自由能(ΔG_MMGBSA)为-37.11 kcal/mol，主要驱动力为范德华力(ΔV_DWAALS=-38.93 kcal/mol)和非极性溶剂化能(ΔE_SURF=-5.61 kcal/mol)。

piperitone与BtsuOr7a-4的结合也表现出高稳定性，配体RMSD持续保持在0.04 nm左右。MM/PBSA计算估计结合自由能为-23.56 kcal/mol，范德华力(ΔV_DWAALS=-26.55 kcal/mol)是主要驱动力。综合分析表明，BtsuOR与trans-nerolidol和piperitone的结合主要由疏水相互作用驱动，核心结合口袋残基如BtsuOr7a-6中的VAL197和BtsuOr7a-4中的LEU195在稳定配体相互作用中起关键作用。

研究结论与讨论

本研究成功组装了橘小实蝇的高质量染色体级别基因组，为理解其寄主专一性的遗传基础提供了重要资源。比较基因组学分析揭示了橘小实蝇化学感受基因家族的显著收缩，这一发现与其它寡食性昆虫的研究结果一致，表明基因家族收缩可能是专一性昆虫适应窄寄主范围的重要进化策略。

功能研究表明，BtsuOBP83a通过特异性结合柑橘关键挥发物trans-nerolidol和piperitone，在寄主识别中起关键作用。分子对接和动力学模拟进一步证实BtsuOr7a-6和BtsuOr7a-4是识别这些挥发物的主要受体。这些发现从分子水平揭示了橘小实蝇专一性识别寄主的机制，为理解寡食性昆虫的嗅觉适应提供了新视角。

从进化角度看，寡食性代表了一种与多食性截然不同的生态策略。寡食性昆虫如橘小实蝇通过精细调整其化学感受和解毒系统，实现了对特定寄主的高效利用，但这种专一性也使其更容易受到寄主可得性波动和环境变化的影响。本研究不仅增进了对昆虫寄主专一性进化机制的理解，也为开发基于行为调控的害虫治理策略提供了潜在靶点。

未来研究可通过异源表达系统进一步验证这些关键受体的功能，并通过行为实验确认关键挥发物的生态相关性，为橘小实蝇的绿色防控提供新思路。