在Rhipicephalus sanguineus的唾液腺中发现新型抗凝蛋白及其与凝血因子X的相互作用

《Experimental Parasitology》：Novel anticoagulant proteins identified in the salivary glands of Rhipicephalus sanguineus and their interaction with coagulation factor X

本研究利用酵母双杂交技术从硬蜱R.sanguineus唾液腺中鉴定出122个与凝血因子X（FX）互作的蛋白质，其中22个为未表征蛋白。通过分子克隆和表达验证，发现铁蛋白样蛋白（Rs SF）、酪氨酸蛋白磷酸酶Lar样蛋白（Rs TPP）和延伸因子1α（Rs EF-1 alpha）具有显著抗凝血活性，分别使凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）延长，并降低纤维蛋白原（FIB）水平。分子对接显示这三个蛋白与FX形成高置信度结合界面，通过疏水作用等机制稳定结合。该研究为开发新型抗凝血药物提供了重要候选分子。

　　### 解读：从吸血节肢动物唾液腺中发现与凝血因子X相互作用的抗凝血蛋白及其潜在应用

#### 引言

在自然界中，吸血节肢动物，如蜱虫、蚊子、虱子等，为了成功进行吸血行为，它们的唾液腺会分泌多种抗凝血化合物。这些抗凝血分子通过干扰宿主的凝血级联反应，防止血液在吸血部位迅速凝固，从而确保血液流动畅通，为吸血提供便利。凝血因子X（Factor X, FX）是宿主凝血系统中的一个关键组成部分，其激活形式FXa能够催化凝血酶原转化为凝血酶，进而启动一系列反应，最终导致血栓形成和止血过程。然而，为了实现成功的吸血，这些节肢动物必须绕过宿主的凝血系统，因此它们分泌的抗凝血蛋白与FX发生特定的相互作用，从而抑制其活性或调节其功能，以干扰凝血级联的正常进行。

这项研究利用酵母双杂交技术（Y2H）对蜱虫唾液腺中的蛋白质编码序列进行了深入分析，发现了122种与FX相互作用的蛋白质，其中100种已被研究，22种尚未被充分研究。进一步选择其中三种蛋白质——铁蛋白样蛋白（soma ferritin-like, Rs SF）、酪氨酸蛋白磷酸酶Lar样蛋白（tyrosine-protein phosphatase Lar-like, Rs TPP）以及延伸因子1α（elongation factor 1 alpha, Rs EF-1 alpha）——对其抗凝血功能进行了验证。这些蛋白质在四个关键凝血参数（凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间APTT、凝血时间TT以及纤维蛋白原FIB水平）中表现出显著影响，延长了PT、APTT和TT，同时降低了FIB水平。这表明这些蛋白质可能通过干扰外源性和内源性凝血途径，影响纤维蛋白原的合成、代谢或功能活动，从而发挥抗凝血作用。

此外，通过分子对接模拟，研究人员发现这些蛋白质与FX之间形成了稳定的、特异的蛋白质-蛋白质复合物，这些相互作用主要由疏水作用力介导。高置信度评分和多样化的相互作用模式说明这些蛋白质在进化过程中已经优化，以实现与FX的紧密、特异性结合。研究结果不仅揭示了这些蛋白质的潜在抗凝血特性，还强调了从自然来源探索新药物的重要性，以拓展心血管医学领域的药物管线。

#### 材料与方法

研究的第一步是构建酵母双杂交cDNA文库。研究人员从成年雌性Rhipicephalus sanguineus（犬蜱）中提取了唾液腺组织，并通过一系列步骤，包括总RNA提取、cDNA合成和文库构建，最终形成了一个具有高容量的cDNA文库。该文库的容量约为3.0×10^7个菌落形成单位（CFU），远高于通常设定的标准容量1×10^7 CFU。为了验证文库的质控效果，研究人员随机选取了文库中的单克隆样本，通过菌落PCR检测其片段长度，发现片段长度范围为750至2000 bp，平均长度超过1000 bp，表明文库的质量良好。

接下来，研究人员利用Y2H技术对FX分子进行了筛选。他们构建了四种不同的诱饵质粒（pBT3-N-FX、pBT3-C-FX、pBT3-SUC-FX和pBT3-STE-FX），并将其与目标蛋白的质粒（pOst1-NubI）共转化到酵母菌株NMY51中。通过观察在不同选择性培养基上的菌落生长情况，研究人员评估了这些质粒的适配性。其中，pBT3-SUC-FX表现出了最佳的筛选效果，尽管其自转录激活活性相对中等。

为了确保筛选的准确性，研究人员还进行了自转录激活抑制实验。当将pPR3-N与pBT3-SUC-FX共转化到NMY51酵母细胞中，并在含有5 mM 3-AT的培养基上培养时，未观察到菌落生长，这表明3-AT可以有效抑制pBT3-SUC-FX的自转录激活现象，从而提高筛选的特异性。

随后，研究人员对文库的转化效率进行了评估。通过在三个连续的筛选过程中观察到超过1000个独立的单菌落，表明文库转化效率很高，达到了1.0×10^6 CFU的标准。这一结果表明，该研究的方法具有较高的可重复性和可靠性。

为了进一步筛选与FX相互作用的蛋白质，研究人员将文库中的蛋白质序列与GenBank数据库进行比对，使用BLAST算法进行序列分析。经过仔细排除重复序列和非mRNA序列，最终确认了122个与FX相互作用的蛋白质编码序列，其中100个为已知蛋白质，22个为未知蛋白质。这些蛋白质包括铁蛋白样蛋白、酪氨酸蛋白磷酸酶Lar样蛋白以及延伸因子1α，它们在蜱虫体内参与铁离子稳态维持、信号通路调节和抗凝血相关蛋白的合成。

接下来，研究人员通过表达系统（如Expi293细胞）表达了这些蛋白质，并对其进行了纯化和功能分析。通过使用Ni-TED柱进行纯化，结合SDS-PAGE和超滤技术，研究人员对蛋白质的浓度进行了精确测量。此外，他们还使用BCA试剂盒对蛋白质浓度进行了定量分析，以确保实验的准确性。

#### 结果

在抗凝血活性检测实验中，研究人员将三种重组蛋白（Rs SF、Rs TPP和Rs EF-1 alpha）与人外周血浆混合，以评估其对四个关键凝血参数的影响。实验结果显示，所有三种重组蛋白均显著延长了PT、APTT和TT，并同时降低了FIB水平。这些结果表明，这些蛋白质能够延缓凝血过程并减少纤维蛋白原的含量。

具体而言，Rs SF和Rs EF-1 alpha在与阴性对照相比时表现出高度显著的差异（P < 0.01），说明它们具有较强的抗凝血活性。而Rs SF在与阳性对照（肝素溶液）相比时也表现出显著的抗凝血效果（P < 0.05），尽管其对TT和FIB的影响不如对PT和APTT那样显著。相比之下，Rs TPP虽然在与阴性对照相比时对所有四个凝血参数均有显著影响（P < 0.05），但在与阳性对照相比时，其对APTT和FIB的影响更加显著（P < 0.01），表明Rs TPP可能通过特定的机制影响内源性凝血途径或选择性干扰纤维蛋白原的代谢。

通过分子对接分析，研究人员进一步揭示了这些蛋白质与FX之间的相互作用模式。Rs SF、Rs TPP和Rs EF-1 alpha分别与FX形成了高置信度的结合（0.857、0.881和0.876），这表明它们能够与FX形成稳定的、特异的蛋白质-蛋白质复合物。在这些相互作用界面中，观察到了多种相互作用模式，包括氢键、盐桥和疏水作用力。例如，在Rs SF与FX的结合界面中，Rs SF的Met54、Ala57、Ala58、Ala61、Ala71、Ile89和Val99残基与FX的Phe213、Leu326、Pro329和Met464残基之间形成了疏水相互作用。类似地，在Rs TPP与FX的结合界面中，Rs TPP的Phe82、Ala83、Pro85、Pro167、Ala168、Ala170、Leu218、Val219、Leu222、Val227、Pro249和Met251残基与FX的Leu105、Val147、Leu148、Leu157、Pro184、Leu206和Ala208残基之间形成了疏水相互作用。而在Rs EF-1 alpha与FX的结合界面中，Rs EF-1 alpha的Ile71、Ile73、Ile75、Ile90、Val264、Val308、Gly309、Leu347和Val435残基与FX的Leu230、Ile233、Phe258、Met368、Gly369、Ala407、Trp437和Ala442残基之间形成了显著的疏水相互作用网络。这些结果不仅验证了这些蛋白质与FX的相互作用，还表明它们在凝血机制中可能扮演了重要的角色。

#### 讨论

本研究的结果表明，从吸血节肢动物唾液腺中分离出的三种蛋白质——Rs SF、Rs TPP和Rs EF-1 alpha——可能在抗凝血过程中发挥重要作用。这些蛋白质不仅影响了外源性凝血途径，还干扰了内源性凝血途径，从而显著延长了PT、APTT和TT，并降低了FIB水平。这种多方面的抗凝血作用可能意味着这些蛋白质在凝血机制中具有不同的作用路径，这为开发新型抗凝血药物提供了潜在的靶点。

值得注意的是，Rs SF和Rs EF-1 alpha的抗凝血效果显著高于Rs TPP，尤其是在与阴性对照相比时。这可能表明Rs SF和Rs EF-1 alpha在抗凝血机制中更为关键。此外，Rs SF在与阳性对照（肝素溶液）相比时也表现出显著的抗凝血效果，说明它可能具有与肝素类似的抗凝血机制，但其作用路径可能有所不同。

从进化角度来看，这些蛋白质与FX的特异性结合可能是吸血节肢动物适应性进化的一部分。通过长期的自然选择，这些蛋白质可能已经优化了其与FX的结合能力，以确保在吸血过程中能够有效干扰宿主的凝血反应。这种进化适应性不仅有助于节肢动物的生存，还可能为人类医学提供新的研究方向和治疗策略。

然而，本研究也存在一些局限性。首先，体外实验的结果可能无法完全反映体内情况，因为体外环境与体内环境存在差异，可能影响蛋白质的活性和相互作用模式。其次，分子对接分析依赖于已有的数据和假设，可能无法完全准确地预测蛋白质的结合界面和相互作用模式。此外，本研究仅关注了三种特定的蛋白质，这可能意味着对蜱虫抗凝血机制的全面理解仍存在不足。

尽管如此，本研究的结果仍然具有重要的科学价值和应用潜力。通过深入研究这些蛋白质的抗凝血功能，研究人员不仅揭示了它们在凝血机制中的作用，还为开发新型抗凝血药物提供了理论依据和实验支持。这些蛋白质可能成为未来抗凝血和抗血栓治疗的重要候选药物，特别是在针对纤维蛋白原的药物开发方面。

#### 结论

本研究展示了从吸血节肢动物唾液腺中发现的抗凝血蛋白的潜力，并通过实验验证了它们的抗凝血活性。这些蛋白质不仅对凝血因子X（FX）表现出显著的相互作用，还通过多种机制影响凝血过程，如延长PT、APTT和TT，同时降低FIB水平。分子对接分析进一步证实了这些蛋白质与FX之间形成了稳定的、特异的蛋白质-蛋白质复合物，这为理解它们在凝血机制中的作用提供了分子层面的证据。

此外，本研究强调了探索自然来源以发现新药物的重要性。吸血节肢动物作为潜在的生物资源，其唾液腺分泌的抗凝血蛋白可能为心血管医学提供新的治疗策略。未来的研究可以进一步优化这些蛋白质的表达和纯化方法，探索其在体内的作用机制，并评估其在临床应用中的潜力。通过深入研究这些蛋白质的生物学功能和相互作用模式，科学家们有望开发出更加安全和有效的抗凝血药物，为心血管疾病的治疗提供新的解决方案。