双模式适配体驱动的生物传感平台，用于超灵敏且抗突变地检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白

《General and Comparative Endocrinology》：Dual-mode aptamer-driven biosensing platform for ultrasensitive and mutation-resilient detection of the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein

SARS-CoV-2 N蛋白检测中，通过SELEX筛选获得高特异性aptamer NP14，并构建双模检测平台MD ELAAA，结合金纳米花多色显色和动态光散射技术，灵敏度达0.43 TCID50/mL，较传统方法提升47倍，适用于变异株监测和快速诊断。

　　本研究旨在解决SARS-CoV-2病毒快速进化和高突变率所带来的检测挑战，提出了一种双模式的适配子检测平台，以提高现有分子诊断方法的灵敏度和突变容忍度。SARS-CoV-2是一种在人类健康中具有重大威胁的病毒，其突变特性使得传统的诊断手段难以保持稳定性和准确性。因此，开发一种能够快速、直观、高灵敏度且特异性强的检测技术，对于应对这一全球性健康问题至关重要。本研究中，我们通过X-适配子系统进化方法（SELEX）筛选出一种高亲和力的DNA适配子NP14，它能够特异性地与SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）的N端结构域结合。通过分子对接、适配子截断和定向诱变实验，我们进一步揭示了NP14与SARS-CoV-2和SARS-CoV N蛋白结合的关键核苷酸C24和G27，以及其结构决定因素。基于这一发现，我们构建了一种结合适配子与抗体的双模式检测系统，即多色动态光散射增强的酶联适配子-抗体检测（MD ELAAA），从而实现了高灵敏度和高特异性的检测。

在研究中，我们发现NP14具有优异的亲和力，能够识别包括alpha、beta、gamma、delta、lambda和omicron在内的多个SARS-CoV-2变种。这一发现不仅展示了NP14在抗原检测中的广泛适用性，也表明其在应对病毒变异方面具有重要的潜力。我们通过多色检测方法和动态光散射技术的结合，成功提升了检测的灵敏度，使其达到0.39 pg/mL的水平，这比传统方法提高了47倍。此外，NP14的检测能力不受温度影响，能够在室温下实现高通量检测，进一步拓展了其在临床诊断中的应用范围。

为了验证NP14的结合特性，我们进行了多种实验，包括表面等离子体共振（SPR）分析、流式细胞术和共聚焦显微镜成像。SPR分析提供了精确的结合动力学参数，如结合常数（Kd）和解离速率（kd），而流式细胞术和共聚焦显微镜则直观地展示了NP14与SARS-CoV-2 N蛋白结合的强度和特异性。这些实验不仅验证了NP14的高亲和力，还揭示了其在不同环境下的稳定性和耐受性。通过对比实验，我们发现NP14相较于其他已知的适配子具有更强的结合能力，这表明其在检测中具有显著的优势。

为了进一步探究NP14与SARS-CoV-2 N蛋白的结合机制，我们利用分子对接技术分析了适配子与蛋白质的相互作用。结果表明，NP14的P1区域（C24和G27）在结合过程中起着关键作用，而P2区域则对维持适配子的二级结构至关重要。通过改变这些关键核苷酸并评估其对结合能力的影响，我们进一步确认了NP14的结构特征。此外，我们还发现NP14的结合能力不受血清干扰，能够在血清环境中保持结构的完整性，这为其在实际检测中的应用提供了重要的依据。

在构建检测平台方面，我们设计了一种双模式的MD ELAAA方法，该方法结合了非聚集的等离子体比色法和动态光散射技术。通过使用金/银纳米材料（Au/AgNPs）来放大光学和散射信号，MD ELAAA实现了高灵敏度的定量分析和直观的视觉检测。这一平台能够通过颜色变化和光散射强度的变化，提供两种不同的检测信号，从而提高了检测的可靠性和准确性。通过优化实验条件，我们成功地提高了检测的灵敏度，使其能够检测到低浓度的SARS-CoV-2 N蛋白，这在实际应用中具有重要意义。

此外，我们还对MD ELAAA平台的性能进行了评估。通过比较传统的双抗体夹心法和我们提出的双模式检测方法，我们发现MD ELAAA在灵敏度和特异性方面具有明显优势。传统方法通常受到空间位阻和检测灵敏度的限制，而MD ELAAA通过适配子和抗体的结合，有效克服了这些问题。同时，我们利用动态光散射技术实现了对检测信号的精确量化，进一步提高了检测的准确性。这些实验结果表明，MD ELAAA不仅在检测灵敏度上优于传统方法，而且在检测特异性方面也表现出色，能够有效区分目标抗原与其他非目标蛋白。

为了验证MD ELAAA的实用性，我们进行了病毒培养液的检测实验。通过将病毒培养液与NP14结合，我们观察到明显的颜色变化和光散射信号，这表明该平台能够有效地检测到病毒的存在。此外，我们还评估了MD ELAAA与其他已知检测方法的比较，发现其在灵敏度和检测范围上均具有显著优势。这些结果不仅证明了MD ELAAA的可行性，也为未来在病毒监测和临床诊断中的应用提供了坚实的基础。

在研究的最后，我们讨论了MD ELAAA平台的优势和潜在应用。该平台结合了非聚集的等离子体比色法和动态光散射技术，能够实现视觉和定量检测的双重目标。这一创新方法不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测的特异性，使其在应对病毒变异方面具有重要的应用价值。同时，我们还指出，尽管该平台在实验室环境中表现出色，但在实际应用中仍需进一步优化，例如简化检测流程，提高检测效率，以及增强其在点对点检测中的适用性。

综上所述，本研究通过筛选和验证NP14这一高亲和力的DNA适配子，构建了一种双模式的MD ELAAA检测平台，该平台在检测SARS-CoV-2 N蛋白和病毒变种方面表现出卓越的性能。这一成果不仅推动了病毒检测技术的发展，也为未来的临床诊断和公共卫生监测提供了新的思路和方法。随着技术的不断进步和应用的不断拓展，MD ELAAA有望成为下一代病毒检测和监控的重要工具，为应对未来的公共卫生挑战提供有力支持。