法医粪便学：通过全面分子分析古代及现代粪便样本，揭示地中海僧海豹的秘密生活习性

《Global Ecology and Conservation》：Forensic scatology: insights into the secretive Mediterranean monk seal via a comprehensive molecular analysis of aged and recent fecal samples

地中海僧侣海豹粪便DNA分析显示，采用九种分子标记可准确鉴定物种、推断饮食（以骨鱼为主）、性别及种群遗传结构，并通过降解特征评估样本年龄，证实粪便DNA技术能有效监测该濒危物种的遗传多样性和种群结构。

　　### 非侵入性方法在地中海僧海豹研究中的应用

地中海僧海豹（*Monachus monachus*）是地中海海豹中唯一的特有物种，也是当前人类世中最易受威胁的哺乳动物之一。它面临着栖息地退化、人类干扰以及气候驱动的生态系统变化等多重压力。由于其隐秘的习性和对难以进入区域的偏好，这种动物的监测工作始终充满挑战，大多数观察都是偶然的，难以提供深入的生物学信息。因此，开发创新的非侵入性方法以提升其保护效果显得尤为迫切。

本研究采用了一种基于粪便DNA分析的方法，探索其在快速变化环境下的应用潜力。通过分析来自不同地点和时间跨度超过十年的八份粪便样本，我们利用了九种不同的遗传分析方法，获得了关于其饮食结构、性别识别、基因型特征等关键生物学信息。研究发现，即使在酒精中保存多年的样本仍能保留大量的宿主DNA，但食物DNA的降解更为明显。粪便DNA的降解不仅会影响数据质量，同时也能为粪便的年龄和相关的生态行为提供线索。

### 方法与材料

本研究基于对八份地中海僧海豹粪便样本的分子分析。这些样本从2011年至2024年间在意大利半岛周围的三个不同区域收集：北方亚得里亚海（n=2）、东北部爱奥尼亚海（n=3）和西西里海峡（Favignana岛，n=3）。其中五份较旧的样本在收集后立即被保存在干燥状态或酒精中，而三份较新的样本则在收集后被冷冻，但在运输过程中经历了多次冻融循环。这些样本分别使用了两种不同的Qiagen DNA提取试剂盒进行处理：Dneasy Power Soil用于较旧样本，而QIAamp PowerFecal用于较新样本。

对于较旧样本的提取过程，在之前的文献中已有详细描述（Valsecchi et al., 2022）。而对于2024年的样本，根据制造商的协议，使用了0.1克至0.2克的解冻粪便进行DNA提取。所有样本均经过多方面的分子分析，包括：1）使用高通量测序技术进行广泛的代谢条形码分析，以更好地了解饮食结构；2）通过使用多个引物对进行基因型分析，以推断种群来源；3）通过分子性别鉴定方法确定个体的性别。总共使用了九对引物，分别针对核基因组和线粒体基因组。

### 分子分析与结果

在分子分析过程中，我们采用了三种主要类型的检测方法：1）广泛的代谢条形码高通量测序（HTS）分析，使用了三种引物对；2）每份样本的基因型分析，使用了四种引物对以推断种群来源；3）分子性别鉴定，使用了两种引物对进行多重实时定量PCR（qPCR）分析。所有样本均使用这些引物对进行了检测，从而获得了丰富的生物学信息。

通过代谢条形码分析，我们成功鉴定了所有八份样本中的宿主DNA，其中样本Fec1表现较差，可能由于其DNA降解程度较高。在其他样本中，宿主DNA的占比通常在70.2%至94.5%之间，显示出宿主DNA在样本中的主导地位。对于饮食成分的分析，我们发现多个样本中包含了丰富的鱼类和软体动物DNA，其中Fec8表现出最高的饮食多样性，包括13种鱼类和2种双壳类软体动物。这些结果表明，地中海僧海豹主要依赖于近岸环境中的食物资源，尤其是浅水区域的底栖生物。

此外，我们还通过分析线粒体控制区（CR）基因型，成功鉴定了所有样本的基因型。结果显示，MM01和MM03是当前最常见于地中海地区的两个基因型，而其他基因型则在历史样本中更为常见。这些基因型的分布进一步支持了地中海僧海豹过去曾存在广泛的种群结构，随后由于环境压力和人类活动的影响，种群发生了显著的基因流失和地理分化。

### 研究意义与展望

本研究不仅验证了粪便DNA分析作为一种非侵入性工具的有效性，还展示了其在获取多样化的生物学信息方面的潜力。通过这种技术，我们可以获得关于饮食结构、健康状况、基因多样性、种群结构等多方面的信息，而无需直接接触动物。这在研究稀有、受保护或难以接近的物种时具有显著优势。

此外，我们还发现，粪便DNA分析可以用于估算样本的年龄。通过观察宿主和食物DNA信号的强度变化，以及分解者（如真菌和细菌）DNA的出现，可以间接推断出粪便的年龄。这种“分子时钟”方法为理解个体的活动模式，尤其是在繁殖季节等关键时期，提供了新的视角。

尽管我们未对微生物群落进行专门分析，但一些样本中仍然检测到了大量的细菌和真菌序列，这可能有助于估算粪便的年龄。然而，对于更精确的微生物群落分析，需要使用专门的微生物标记，这可能超出了本研究的范围。

本研究的发现强调了非侵入性分子技术在现代生态学和保护生物学中的重要性。通过这些方法，我们不仅能够更有效地监测地中海僧海豹的种群动态，还能为制定保护策略提供科学依据。在人类世背景下，这种技术对于应对人类活动和环境变化带来的挑战具有重要意义，为保护濒危物种提供了新的工具和方法。