综述：人乳寡糖的生物合成制备及其应用的进展

《Glycoscience & Therapy》：Advances in Biosynthetic Preparation and Application of Human Milk Oligosaccharides

人类初乳寡糖（HMOs）的生物合成与应用研究综述，重点分析中性岩藻糖基（2'-FL、3-FL）、中性非岩藻糖基（LNT、LNnT）及酸性岩藻糖基（3'-SL、6'-SL）的代谢工程与酶催化合成策略，探讨大肠杆菌等底盘细胞的优化、关键酶（如岩藻糖转移酶）的改造及大规模生产的挑战，并总结HMOs在婴幼儿配方奶粉、功能性食品和药物开发中的应用前景与瓶颈。

　　人类乳糖寡糖（HMOs）是母乳中存在的一类具有生物活性的复杂糖分子，它们在婴儿肠道微生物群的形成和增强婴儿免疫系统及对多种病原体的抵抗力方面发挥着重要作用。随着对HMOs在婴儿营养和健康领域的深入研究，其在婴儿配方奶粉和食品中的应用日益广泛。目前，HMOs的合成与应用已成为研究的热点，涉及多种合成策略及技术进展，旨在实现其大规模生产并拓展其在食品和制药领域的应用。

HMOs的合成主要包括化学合成、酶催化合成和全细胞生物合成三种方式。化学合成虽然能够获得高纯度的产物，但通常步骤繁琐、产率较低，且需要使用昂贵或有毒的试剂，这限制了其在工业生产中的应用。相比之下，酶催化合成具有更高的选择性和反应效率，但受酶活性和底物供给的限制，难以实现高产率。全细胞生物合成方法则通过基因工程改造微生物，使其能够高效合成HMOs，这种方法在成本和效率上展现出更大的优势，成为当前最具潜力的合成路径。

目前，研究者们主要关注几种具有商业价值的HMOs，包括2'-FL、3-FL、DFL、LNT、LNnT、LNT II、3'-SL和6'-SL。这些HMOs的合成路径各有不同，其中，2'-FL和3-FL的合成涉及α-1,2-或α-1,3-糖基转移酶，而DFL的合成则需要同时进行两种糖基转移酶的催化作用。LNT和LNnT的合成则依赖于β-1,3-或β-1,4-糖基转移酶，以及糖基供体的高效供应。此外，酸性HMOs（如3'-SL和6'-SL）的合成则需要引入神经氨酸（Neu5Ac）作为糖基供体，这通常涉及到CMP-神经氨酸的合成与转移过程。

在HMOs的合成过程中，关键的挑战包括如何提高底物的供给效率、优化酶的表达与活性、减少副产物的形成，以及如何在大规模生产中维持产品的纯度和稳定性。对于某些HMOs，如2'-FL和3-FL，研究人员通过代谢工程手段对宿主菌株进行改造，如敲除竞争性代谢通路基因、过表达关键酶基因、优化碳源和诱导条件等，以提高合成效率。例如，通过基因工程手段，研究者在大肠杆菌中成功构建了2'-FL的合成路径，并在发酵过程中实现了较高的产率。而对于3-FL的合成，由于关键酶的表达效率较低，研究者采取了多种策略，包括基因修饰、酶的定向进化以及优化反应条件，以提高其合成效率。

此外，HMOs的合成还受到宿主菌株的代谢能力和基因表达调控的影响。不同菌株在HMOs合成中的表现各异，一些菌株如大肠杆菌因其在基因工程方面的优势而被广泛使用，但其潜在的毒性也限制了其在食品工业中的应用。因此，寻找更加安全的宿主菌株成为当前研究的一个重要方向。同时，研究者还关注如何提高HMOs的合成效率，例如通过引入多基因调控系统、优化发酵工艺以及采用高通量筛选技术，以实现更高效的合成路径。

HMOs在食品工业中的应用已经取得了一定的进展，尤其是在婴儿配方奶粉领域。目前，一些国际知名的婴儿奶粉品牌，如Nestlé和Wyeth，已经将2'-FL、3-FL、LNT和LNnT等HMOs作为功能性成分添加到其产品中，以增强婴儿的肠道健康和免疫功能。同时，HMOs也被用于功能性食品和饮料中，如低糖酸奶、运动饮料和能量水等，以满足消费者对健康食品的需求。在制药领域，HMOs因其潜在的治疗作用，如预防和治疗婴儿腹泻、调节肠道菌群、增强免疫功能等，正在被进一步研究和开发。

然而，尽管HMOs在应用方面取得了显著进展，其大规模生产仍面临诸多挑战。首先，合成路径的复杂性导致生产成本较高，尤其是在涉及多步反应和多种酶的协同作用时。其次，不同HMOs的合成对底物和酶的要求各异，这使得合成过程需要高度的定制化。此外，HMOs的分离与纯化过程也十分复杂，尤其是在需要获得高纯度产品的情况下，传统的方法可能无法满足要求，需要开发更高效的分离技术。这些挑战促使研究者不断探索新的合成策略和优化方法，以提高生产效率和产品质量。

为了应对这些挑战，研究者们正在探索多种合成策略，包括代谢工程、合成生物学以及多酶系统的设计。通过优化宿主菌株的代谢网络、提高关键酶的表达水平和催化效率，以及采用新的发酵工艺，HMOs的合成效率得到了显著提升。例如，一些研究团队已经实现了在5升发酵罐中获得较高浓度的HMOs，如3-FL和6'-SL，这些成果为HMOs的大规模生产提供了重要的参考。同时，研究者还在探索如何通过基因调控和代谢优化，提高HMOs的合成产量，并减少副产物的形成。

在HMOs的未来发展方向中，研究者们提出了多个潜在的优化策略。例如，通过整合新型代谢通路，如从头合成和补救合成路径，可以提高HMOs的生产效率。此外，开发更高效的酶系统，如通过定向进化和蛋白质工程手段优化酶的活性和稳定性，也是提升HMOs合成效率的重要方向。同时，研究者们也在探索如何利用更低成本的碳源，如甘油和葡萄糖，来降低生产成本。这些策略的实施将有助于推动HMOs的工业化生产，并进一步拓展其在食品和制药领域的应用。

HMOs的合成与应用不仅关乎技术层面的突破，也涉及到对市场需求的精准把握。随着消费者对健康食品和功能性成分的关注度不断提升，HMOs的市场需求也在不断扩大。因此，研究者们在开发新的合成方法的同时，也在关注如何满足不同市场对HMOs的需求。例如，某些HMOs可能更适合用于婴儿配方奶粉，而另一些则可能更适用于成人功能性食品或药品。这种差异化需求促使研究者们进一步细分HMOs的应用领域，并针对不同应用场景优化其合成路径。

总之，HMOs的合成与应用正处于快速发展的阶段。尽管目前仍面临诸多技术挑战，但通过代谢工程、合成生物学和多酶系统设计等手段，研究者们已经取得了显著进展。未来，随着技术的不断成熟和市场需求的持续增长，HMOs有望在更多领域得到应用，为人类健康带来更大的益处。同时，进一步优化合成路径、提高生产效率和降低成本，将是推动HMOs产业化的重要方向。