具有TP53突变的人类输卵管上皮类器官能够再现浆液性输卵管上皮内癌（STIC）的特征

《Gynecologic Oncology》：Human fallopian tube epithelial organoids with TP53 mutation recapitulate features of serous tubal intraepithelial carcinoma (STIC)

建立TP53缺失功能的输卵管上皮器官oid模型以模拟STIC病变，通过CRISPR-Cas9编辑人输卵管上皮细胞，生成具有增殖增强、核异常、染色体不稳定性及EMT通路激活特征的STIC模型，为卵巢癌早期机制研究提供工具。

　　

Judith Kraiczy|Bo Yu

斯坦福大学医学院妇产科，美国加利福尼亚州斯坦福市

摘要

目的

严重输卵管上皮内癌（STIC）是高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的直接前体病变，并且普遍存在TP53突变。由于缺乏合适的STIC体外模型，对其发病机制的研究面临重大挑战。我们的目标是开发一种能够模拟STIC病变的人体体外模型。

方法

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，我们生成了具有TP53功能缺失突变（TP53- FTOs）的人类输卵管上皮类器官。我们通过免疫荧光共聚焦成像、拷贝数变异（CNV）分析和RNA测序在细胞和分子水平上对TP53- FTOs进行了表征。

结果

TP53- FTOs再现了STIC病变的关键特征，表现出增殖增加和核异常，包括核增大及非典型有丝分裂形态。拷贝数变异分析显示某些TP53- FTOs存在非整倍体现象。与未经编辑的对照组相比，TP53- FTOs显示出显著的转录组变化，包括DNA修复基因下调和上皮-间充质转化（EMT）通路上调。与STIC病变类似，TP53- FTOs中纤毛细胞数量显著减少，与纤毛生成相关的基因表达也降低。

结论

这些发现表明，TP53的缺失促进了细胞增殖和基因组不稳定状态，这有利于癌症的发生。我们开发的TP53- FTO模型为研究卵巢癌早期事件以及开发早期检测和预防卵巢癌的新策略提供了有价值的工具。

引言

卵巢癌（OC）是最致命的妇科恶性肿瘤之一，5年生存率仅为50% [1]。由于缺乏早期检测方法，70%的卵巢癌在晚期（III-IV期）才被诊断出来，此时预后较差 [1]。最常见的卵巢癌亚型是高级别浆液性卵巢癌（HGSOC），占卵巢癌的约70%，且预后最差 [1]。大多数HGSOC被认为起源于输卵管上皮（FTE）细胞 [2], [3], [4], [5]。严重输卵管上皮内癌（STIC）已被确认为HGSOC的直接前体 [6], [7], [8]。STIC病变定义为局部上皮区域，由由于TP53基因突变而发生p53免疫染色改变的非纤毛细胞组成，同时伴有核增大、细胞极性丧失和有丝分裂异常等形态学特征 [5,8,9]。大约70-80%的STIC病变表现出高增殖标志物（如Ki67）的标记指数，表明其属于增殖型亚型；相反，其他病变中增殖细胞较少，属于休眠型亚型 [10,11]。STIC病变中存在多种类型的TP53突变 [12,13]。在错义TP53突变中，异常的p53蛋白积累，导致强烈的p53免疫组化染色；而在失活突变中（包括无义突变或移码突变），免疫组化检测中无法检测到p53 [10,12,14]。尤其是邻近HGSOC的STIC病变，会表现出免疫效应因子（如干扰素通路和上皮-间充质转化通路）的基因表达增加 [15]。 由于STIC病变的识别需要固定组织的病理学检查，目前没有可用的活STIC细胞或STIC细胞系用于研究，这限制了我们对从STIC到HGSOC转化过程中致癌因素和分子机制的理解。为了克服这些限制，需要其他体外模型来模拟STIC病变。类器官作为多种癌症的强大体外模型，因其长期存活能力和对组织特异性特征的一致性再现而受到重视 [16]。来自卵巢癌患者的外分泌输卵管上皮类器官（FTOs）在体内与FTE组织特征高度相似，形成由基底膜包裹的管腔结构。FTOs的单层柱状上皮由分泌细胞和纤毛细胞组成 [17,18]。它们具有自我更新能力，并能在长期培养中保持原有的细胞和分子特性，使其成为转化研究的理想模型系统。来自卵巢癌患者的FTOs能够再现其特定的遗传学和药理学反应 [19], [20], [21], [22], [23]。然而，目前尚无能够在体外再现STIC病变特征的人体FTO模型。

为了解决缺乏能够模拟STIC病变特征的人体体外模型的问题，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术生成了具有TP53功能缺失突变（TP53- FTOs）的人类FTE类器官。TP53- FTOs表现出多种模仿STIC病变的形态学和基因组特征。

章节片段

输卵管组织收集和类器官培养

在斯坦福大学机构审查委员会批准的协议（协议编号59189）下，从一名因子宫内膜腺癌接受子宫切除术和双侧输卵管切除术的绝经前患者处获取了输卵管（FT）标本。病理检查显示双侧输卵管正常，子宫内无恶性肿瘤。新鲜的远端FT组织被切碎后，在37°C下用I型胶原酶（Sigma）消化45分钟。

生成具有TP53-突变的人类输卵管上皮类器官（FTOs）

我们从新鲜的人类远端输卵管组织中分离出原代输卵管上皮（FTE）细胞，并将其培养成三维FTOs。FTOs具有类似体内输卵管上皮的结构，由一层极化的柱状上皮构成，管腔内包含分泌细胞和纤毛细胞这两种上皮细胞类型。 我们使用CRISPR-Cas9技术，通过质粒电穿孔方式修改了FTE细胞中的TP53基因。

讨论

目前尚无能够再现STIC病变特征的体外模型，而STIC是HGSOC的直接前体。这一障碍限制了我们对卵巢癌早期发病机制的理解，并阻碍了早期检测和预防策略的开发。为克服这一障碍，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术生成了TP53- FTOs，这些FTOs表现出STIC病变的多个关键特征，包括增殖增加、核异型性和有丝分裂异常。

CRediT作者贡献声明

Judith Kraiczy：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。 Bo Yu：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿撰写、项目监督、实验管理、资金筹集、概念构建。

资金信息

本研究得到了以下机构的资助： 斯坦福癌症研究所女性癌症创新奖、 斯坦福母婴健康研究所、 Akiko Yamazaki和Jerry Yang 儿科转化医学教员学者奖、 NIH（K08CA222835、R01AI139189，资助给BY）。

利益冲突声明

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

作者感谢斯坦福遗传学生物信息学服务中心的Maren Smith博士和Ramesh Nair博士在生物信息学分析方面的贡献。同时感谢妇产科在获取患者样本方面的协助，以及斯坦福大学细胞科学成像核心设施提供的仪器支持。