RT-PCR检测方法的开发用于鉴定Aetokthonos hydrillicola的ITS（内转录间隔区）和毒素基因区域。Aetokthonos hydrillicola是一种已知寄生于入侵物种Hydrilla verticillata（水葫芦）的植物

《Harmful Algae》：RT-PCR assay development of ITS and toxin gene regions of, Aetokthonos hydrillicola, a known epiphyte of the invasive species Hydrilla verticillata

检测水 Hydrilla 上 Aetokthonos hydrillicola 及其毒素的 RT-PCR 方法研究。

　　近年来，随着入侵性水生植物在北美地区，尤其是美国纽约州水域的广泛扩散，一种名为*Aetokthonos hydrillicola*的有毒附生蓝藻引起了科学界的广泛关注。该蓝藻与入侵性水草——水草（*Hydrilla verticillata*）密切相关，并能够产生一种具有强烈神经毒性的溴化化合物——aetokthonotoxin（AETX），以及一种细胞毒性显著的 dolastatin 类化合物——aetokthonostatin（AEST）。这些毒素的存在可能对野生动物和人类健康构成威胁，因此开发一种快速且准确的检测方法显得尤为重要。

*A. hydrillicola* 作为一种附生蓝藻，通常附着在水生植物表面，尤其在水草（*Hydrilla verticillata*）上较为常见。AETX 是一种五溴化生物吲哚生物碱，其合成需要绝对的溴化物环境。因此，尽管 *A. hydrillicola* 可以附着在多种原生和外来水生植物上，如水草（*H. verticillata*）、 Illinois 水葱（*Potamogeton illionoiensis*）、囊泡草（*Utricularia* sp.）、巴西水藻（*Egeria densa*）、欧亚水蜈蚣（*Myriophyllum spicatum*）和美洲水柳（*Justicia americana*），但只有那些能够富集溴化物的植物，例如水草，才更有可能成为 AETX 生产的宿主。这一特性使得 *A. hydrillicola* 在某些环境中成为毒素生成的重要因素。

此外，近年来的研究还揭示了 *A. hydrillicola* 也能够产生一种高活性的 dolastatin 衍生物——AEST。AEST 与 AETX 共存于同一蓝藻体内，其毒性作用可能具有协同效应。例如，Schwark 等人（2023）发现，*A. hydrillicola* 的粗提物比纯 AETX 具有更强的细胞毒性，这表明 AETX 和 AEST 可能共同作用，对生态系统的健康产生更大的影响。因此，了解这些毒素在自然环境中的共存情况，对于评估其对野生动物和人类健康的潜在风险至关重要。

目前，对于 *A. hydrillicola* 及其毒素的监测方法仍然有限。尽管 Breinlinger 等人（2021）和 Schwark 等人（2023）使用了高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）来检测 AETX 和 AEST，但这些方法并不适用于高通量的环境监测。因此，开发一种基于分子生物学技术的快速检测方法成为当务之急。这种技术不仅可以提高检测效率，还能为环境管理者提供及时的决策支持，以减少 *A. hydrillicola* 对生态系统的负面影响。

本研究旨在开发一种快速、准确的分子检测方法，用于识别 *A. hydrillicola* 及其产生的毒素。该方法基于对 *A. hydrillicola* 的 rRNA ITS 区域（ITS1 和 ITS2）以及 AETX 和 AEST 的生物合成基因簇（aetxE、aetxA、aestF 和 aestK）进行特异性分析。通过设计特异性较强的引物和探针，该方法能够有效区分 *A. hydrillicola* 与其他蓝藻种类，并准确检测 AETX 和 AEST 的存在。这种方法的开发，有助于提高对 *A. hydrillicola* 在水生生态系统中的分布和活动的监测能力，从而更好地应对其可能带来的健康风险。

在方法设计过程中，研究人员使用了 PrimerQuest? 工具（Integrated DNA Technologies, Inc.）来设计引物和探针，并通过 BLASTN 对比工具（National Center for Biotechnology Information, NCBI）数据库中的相关序列，确保引物和探针的特异性。选择 GenBank 访问号 OQ325312.1 作为参考序列，研究人员在 1200–1564 bp 的区域进行了特异性优化，以提高检测的准确性。通过实验测试，这些引物和探针能够有效扩增目标基因，且在 *in silico* 检测中表现出高度的特异性。

在方法优化和验证过程中，研究人员对引物和探针进行了细致调整，以确保其在不同环境条件下的稳定性和灵敏度。优化后的引物和探针能够产生小于 120 个碱基对的扩增产物，这种短片段有助于提高检测的效率和准确性。通过一系列实验验证，研究人员确认了这些引物和探针在实际应用中的有效性，并能够准确识别 *A. hydrillicola* 及其毒素的存在。这种方法的开发，为环境管理者提供了一种快速、可靠的工具，以便在面对 *A. hydrillicola* 潜在危害时，能够迅速做出应对措施。

本研究还旨在评估 *A. hydrillicola* 及其毒素在纽约州水域中的分布情况。通过收集来自美国东南部和纽约州东南部湖泊与池塘的样本，研究人员对这些区域的 *A. hydrillicola* 及其毒素进行了系统分析。研究发现，尽管在 Lake Sebago 的水草中通过光学显微镜确认了 *A. hydrillicola* 的存在，但该样本并未检测到 AETX 基因，且 AEST 基因的检测结果为阳性。这一发现表明，尽管 *A. hydrillicola* 在某些环境中可能产生毒素，但其基因表达可能受到环境因素的影响，例如溴化物的浓度。此外，研究还发现，Lake Sebago 的样本中 *A. hydrillicola* 无法通过当前的 ITS 引物和探针进行扩增，这可能意味着该样本属于 *A. hydrillicola* 的不同遗传变种。

这些发现进一步支持了 AEST 基因在 *A. hydrillicola* 的不同遗传变种中可能具有较高的保守性。相比之下，AETX 基因的表达可能因环境条件的不同而有所变化。因此，开发一种能够同时检测 *A. hydrillicola* 及其两种毒素的分子方法，对于全面评估其对生态系统的潜在影响具有重要意义。

通过本研究开发的 RT-PCR 方法，研究人员能够更高效地检测 *A. hydrillicola* 及其毒素的存在。这种方法不仅提高了检测速度，还降低了检测成本，使得环境管理者能够更快地获取数据，并据此制定相应的管理策略。此外，这种方法还可以用于监测不同水域中 *A. hydrillicola* 的分布情况，为生态系统的健康评估提供重要依据。

本研究的成果表明，*A. hydrillicola* 及其毒素的检测方法需要更加精准和高效。通过优化引物和探针的设计，研究人员能够确保检测的特异性和准确性，从而减少误检的可能性。此外，这种方法的开发还为未来的研究提供了基础，使得科学家能够进一步探索 *A. hydrillicola* 的生态学特性及其毒素的生物合成机制。

总的来说，*A. hydrillicola* 及其毒素的检测方法对于环境管理和生态保护具有重要意义。通过本研究开发的 RT-PCR 方法，不仅能够提高检测效率，还能为科学家提供更加全面的数据，以便更好地理解 *A. hydrillicola* 在自然环境中的分布和活动。这种方法的应用，有助于及时发现和应对 *A. hydrillicola* 可能带来的健康风险，从而保护生态环境和人类健康。