UV-B通过双级调控迷迭香酸合成酶（rosmarinic acid synthase），增强了丹参（Salvia miltiorrhiza）中酚酸的生物合成

《Industrial Crops and Products》：UV-B enhances phenolic acid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza through dual-level regulation of rosmarinic acid synthase

本研究发现紫草中UV-B抑制的Kelch重复F-box蛋白基因SmKFB2通过泛素化降解酶SmRAS调控酚酸合成。通过代谢组学、蛋白质组学及Y2H实验证实SmKFB2与SmRAS直接相互作用，影响其稳定性，进而调节紫草中缬草酸（RA）和丹参酚酸B（SAB）的含量。

　　本研究围绕一种名为SmKFB2的基因展开，该基因属于Kelch重复F-box蛋白家族，是水生丹参（*Salvia miltiorrhiza*）中一个重要的调控因子，能够通过后翻译调控机制影响酚酸的积累。水生丹参是一种传统中药，其根部和根茎被广泛用于治疗心血管疾病，并在现代医学中作为丹红注射液和丹参滴丸等药物的重要成分。酚酸类物质，如丹参酸（SAB）和迷迭酸（RA），是丹参中的主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及改善认知功能等生物活性。尽管已有大量研究揭示了这些活性成分的合成途径及其受环境因素调控的机制，但关于SmKFB2如何通过后翻译调控影响SmRAS（Rosmarinic acid synthase，迷迭酸合成酶）的稳定性，从而调节酚酸的合成，尚处于初步探索阶段。

SmKFB2在水生丹参中的表达受到UV-B辐射的抑制，而SmRAS的表达则被UV-B直接促进。这一现象表明，UV-B不仅通过促进SmRAS的基因表达，还通过抑制SmKFB2的表达，间接提高SmRAS的稳定性，从而增强酚酸的合成能力。具体而言，当SmKFB2被过表达时，SmRAS的蛋白水平显著下降，导致酚酸含量减少；而当SmKFB2被敲除后，SmRAS的稳定性增加，进而提升了RA和SAB的积累。这种双向调控机制为理解UV-B如何影响植物次生代谢途径提供了新的视角，也揭示了SmKFB2在其中的关键作用。

为了验证SmKFB2与SmRAS之间的相互作用，研究人员采用了多种实验手段，包括AlphaFold 3结构预测、酵母双杂交实验（Y2H）以及蛋白互作分析。AlphaFold 3的模型预测显示，SmKFB2与SmRAS之间存在高概率的相互作用，且其ipTM（界面预测得分）为0.67，表明两者之间的结合具有一定的特异性。酵母双杂交实验进一步确认了这一互作关系，当SmKFB2与SmRAS共同表达时，能够显著降低SmRAS的蛋白水平，而当SmKFB2缺失F-box结构域的突变体SmKFB2(ΔF)与SmRAS共同表达时，SmRAS的稳定性未受影响。这些结果表明，SmKFB2通过其F-box结构域与SmRAS相互作用，从而调控其稳定性，进而影响酚酸的合成。

在植物中，次生代谢产物的合成通常受到多种因素的调控，包括环境刺激和内部信号通路。UV-B辐射作为一种重要的环境信号，已被证实能够显著提升水生丹参中酚酸的积累。这一现象可能与SmKFB2和SmRAS之间的调控关系有关。研究发现，UV-B不仅促进了SmRAS的基因表达，还抑制了SmKFB2的表达，从而减少SmRAS的降解。这种双重调控机制使得SmRAS的蛋白水平显著提高，进一步增强了酚酸的合成效率。这一发现不仅加深了我们对UV-B如何调控植物次生代谢产物积累的理解，也为提高丹参药材中活性成分的含量提供了新的思路。

此外，研究还探讨了SmKFB2对其他关键酶的影响。通过非靶向代谢组学分析和蛋白质组学研究，研究人员发现SmKFB2的过表达或敲除显著改变了多个与次生代谢相关的蛋白质表达水平。其中，SmRAS的表达变化尤为显著，表明SmKFB2在酚酸合成通路中扮演着重要角色。通过Western blot分析，研究人员进一步验证了SmKFB2对SmRAS蛋白水平的影响，结果表明在SmKFB2过表达的转基因根中，SmRAS的信号明显减弱；而在SmKFB2敲除的转基因根中，SmRAS的信号则显著增强。这表明SmKFB2不仅通过直接调控SmRAS的稳定性，还可能影响整个酚酸合成通路中其他关键酶的表达和活性。

研究还涉及了SmKFB2在水生丹参中的功能定位。通过构建SmKFB2过表达和敲除的转基因根，研究人员发现SmKFB2在根部的表达受到UV-B的抑制，而SmRAS的表达则被UV-B促进。这种现象提示，SmKFB2可能作为负调控因子，通过抑制SmRAS的降解来影响酚酸的合成。同时，SmRAS的表达增加可能有助于提高植物对UV-B辐射的适应能力，从而增强其防御机制。这一发现为植物在面对环境压力时如何调整次生代谢产物的合成提供了新的理论依据。

研究还发现，SmKFB2与SmRAS的互作不仅限于基因层面，还可能涉及更复杂的分子机制。例如，SmKFB2可能通过其Kelch重复结构域识别SmRAS，并将其靶向至泛素-蛋白酶体系统（UPS），从而促进其降解。这一过程可能受到多种因素的影响，包括环境信号、内部调控因子以及细胞内的信号传导通路。为了进一步探究SmKFB2与SmRAS之间的具体作用机制，研究人员还进行了结构建模和蛋白互作分析，以期揭示SmKFB2如何通过其结构域与SmRAS相互作用，并影响其稳定性。

本研究的意义在于，揭示了UV-B如何通过双重调控机制影响酚酸的合成，即通过抑制SmKFB2的表达来减少SmRAS的降解，同时通过促进SmRAS的表达来增加其合成。这一发现不仅有助于理解植物如何响应环境压力，还为农业科学家提供了新的研究方向，即通过调控SmKFB2的表达来提高丹参药材中酚酸的含量。此外，该研究还为利用基因编辑技术改良丹参品种提供了理论支持，表明通过敲除SmKFB2或调控其表达，可以有效提升丹参的药用价值。

研究还涉及了多个实验技术的应用，包括分子克隆、转基因技术、代谢组学分析、蛋白质组学研究以及蛋白互作实验。这些技术的综合运用，使得研究人员能够从多个层面探讨SmKFB2的功能及其调控机制。例如，通过非靶向代谢组学分析，研究人员能够识别出在SmKFB2过表达或敲除情况下，哪些代谢物发生了显著变化；而通过蛋白质组学分析，则能够进一步揭示这些变化背后的分子机制。此外，酵母双杂交实验和免疫印迹分析为SmKFB2与SmRAS之间的互作提供了直接证据。

在实际应用层面，本研究的发现可能对丹参的栽培和药用价值提升具有重要意义。通过调控SmKFB2的表达，可以有效增强丹参中SAB和RA的积累，从而提高其药用价值。此外，研究还提示，SmKFB2可能是一个潜在的靶点，用于开发新的丹参品种，以满足市场需求。然而，研究仍存在一些局限性，例如，SmKFB2是否能够通过泛素化途径直接降解SmRAS，其具体的结合位点和泛素化位点尚未明确。此外，UV-B如何触发SmKFB2的表达抑制，以及这一过程是否涉及其他调控因子，仍是未来研究需要进一步探索的问题。

综上所述，本研究通过系统的分子生物学、代谢组学和蛋白质组学分析，揭示了SmKFB2在水生丹参酚酸合成中的关键作用。SmKFB2通过调控SmRAS的稳定性，间接影响酚酸的积累，而UV-B则通过抑制SmKFB2的表达和促进SmRAS的表达，双重调控酚酸的合成。这一发现不仅丰富了我们对植物次生代谢调控机制的理解，还为丹参的遗传改良和药用价值提升提供了新的思路。未来的研究可以进一步探索SmKFB2的具体作用机制，包括其如何识别SmRAS、如何参与泛素化过程，以及UV-B如何通过特定信号通路调控SmKFB2的表达。这些研究将有助于更全面地理解植物如何适应环境变化，并为农业生产中的代谢调控策略提供理论依据。