抑制AKR1C3可通过阻断TRAF6/NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活，减轻败血症引起的急性肝损伤

《International Immunopharmacology》：Inhibition of AKR1C3 attenuates sepsis-induced acute liver injury by blocking the TRAF6/NF-κB pathway and NLRP3 inflammasome activation

AKR1C3抑制通过调控NF-κB/TRAF6轴减轻脓毒症性肝损伤，为治疗提供新策略。研究利用CLP模型和THLE-2肝细胞系，发现AKR1C3在脓毒症肝损伤中显著上调，通过激活NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路促进肝细胞 pyroptosis和炎症反应。抑制AKR1C3可降低炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，改善肝功能指标ALT/AST，并减轻肝组织病理损伤。机制上，AKR1C3与TRAF6相互作用促进后者泛素化，从而增强NF-κB活性。PMA激活NF-κB可逆转AKR1C3抑制的疗效，证实NF-κB依赖性机制。本研究首次阐明AKR1C3在脓毒症肝损伤中的核心调控作用，为开发靶向AKR1C3/TRAF6/NF-κB通路的治疗药物奠定基础。

　　急性肝损伤（ALI）是危及生命的脓毒症并发症之一，尤其在重症患者中，其临床管理仍面临巨大挑战，目前的治疗手段有限。AKR1C3，作为一种关键的炎症和免疫调节因子，已被确认在脓毒症进展中扮演重要角色。然而，其在脓毒症引发的ALI中的具体功能和分子机制仍不明确。本研究旨在探讨AKR1C3抑制的治疗潜力，并揭示其在ALI发病机制中的作用。通过使用结肠穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型，我们观察到在肝组织中AKR1C3蛋白表达显著上调，且与疾病严重程度相关。AKR1C3的药理学抑制显著减轻了CLP诱导的肝部病理损伤，恢复了肝功能生物标志物，并缓解了全身性炎症反应。在分子机制层面，AKR1C3的抑制通过阻断NOD样受体家族含吡啶结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体的激活，抑制了肝细胞焦亡，并通过失活核因子κB（NF-κB）信号通路减少了促炎性细胞因子的释放。进一步的分子研究表明，AKR1C3通过与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相互作用并增强其泛素化，从而促进下游炎症级联反应。这些发现确定了AKR1C3/TRAF6/NF-κB轴作为脓毒症相关ALI的新调控通路，并提出了AKR1C3抑制作为治疗该严重状况的有前景策略。

脓毒症是一种由感染、休克或严重创伤引发的危及生命的全身炎症反应综合征（SIRS），是重症监护病房（ICU）中死亡的主要原因之一。在病原体入侵后，宿主的先天免疫系统会失调并过度激活，导致促炎性介质如白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-1β的大量释放，形成所谓的“细胞因子风暴”。这种失控的炎症反应导致全身细胞损伤和多器官功能障碍。肝脏是脓毒症损伤的特别易感器官，而急性肝损伤（ALI）已成为影响脓毒症严重程度和患者死亡率的关键因素。脓毒症相关的肝功能障碍包括缺氧性肝炎、肝内胆汁淤积、代谢和凝血相关蛋白合成受损，以及解毒过程的紊乱。尽管其在临床上的重要性已被广泛认可，但脓毒症引发的肝损伤的分子机制仍未完全阐明，这限制了有效靶向治疗的发展。

脓毒症引发的紊乱会导致“细胞因子风暴”并激活多种程序性细胞死亡途径，这些途径共同导致组织损伤和器官衰竭。其中，焦亡，一种高度炎症性的裂解性细胞死亡，已被认为是脓毒症中多器官损伤的关键驱动因素。这种裂解性细胞死亡途径的失调加剧了全身细胞损伤，导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（MODS）和对继发感染的易感性。值得注意的是，肝细胞焦亡已被确认为放大脓毒症引发的肝损伤的关键机制，实验研究表明其抑制可以有效保护脓毒症相关ALI。

AKR1C3是一种多功能酶，属于醛-酮还原酶（AKR）超家族，其在调节前列腺素生物合成、类固醇激素代谢和视黄醇稳态中发挥重要作用，凸显其在维持细胞代谢平衡中的重要性。病理学上，其在多种疾病中的过度表达，包括代谢障碍、激素依赖性和非依赖性恶性肿瘤以及治疗抵抗性癌症，使其抑制成为克服临床药物耐受性的有吸引力的治疗策略。药理学上的AKR1C3抑制具有多模式效应：它抑制过度增殖，减轻炎症级联反应，并促进滑膜细胞的凋亡，这表明其在治疗骨关节炎中的潜在应用。此外，AKR1C3的基因沉默已被证明可以抑制异种移植模型中的皮下TPC-1肿瘤生长，并通过失活细胞外信号调节激酶（ERK）通路抑制甲状腺癌中由自噬驱动的糖酵解。最近的研究进一步表明，AKR1C3的下调可以增强肝细胞癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，这扩展了其在肿瘤学中的治疗相关性。尽管取得了这些进展，AKR1C3在脓毒症诱导的ALI中的功能作用仍不明确。迄今为止，尚未有全面研究探讨其在此种关键状况下的潜在保护机制。

本研究旨在阐明AKR1C3抑制在脓毒症诱导的ALI中的保护作用。通过建立脓毒症小鼠模型，我们观察到在受损肝组织中AKR1C3的表达显著升高。药理学上的AKR1C3抑制通过抑制两个中心病理途径：（1）NLRP3炎性小体介导的焦亡和（2）NF-κB驱动的炎症，显著减轻了肝损伤并改善了肝功能。在分子机制方面，AKR1C3被发现通过增强TRAF6的泛素化来促进NF-κB的激活。这些发现确定了AKR1C3作为脓毒症相关ALI治疗的新靶点。

在研究方法部分，我们收集了56名脓毒症患者的血清样本，并与56名年龄匹配的健康对照组进行了比较。研究纳入了符合脓毒症诊断标准、年龄至少18岁、有完整的临床记录并提供知情同意的患者。为了确保研究的准确性，我们严格排除了同时患有肝病、免疫疾病、精神疾病、严重器官功能不足、入院24小时内死亡或恶性肿瘤的患者。研究方案已获得赣南医学院第一附属医院伦理委员会的批准（批准号：IRB-GNMU-2024-119B），并在研究开始前获得了所有参与者或其监护人的书面知情同意。在手术后的第二天清晨，从患者中收集静脉血样（3毫升），并在检查当天从健康对照中收集。血清通过1000×g离心10分钟迅速分离，并在-80°C下储存以备后续分析。所有样本在单一批次中统一处理，每份样本进行三次检测。血清中的AKR1C3水平通过商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行定量。

为了进行RNA序列分析，我们从三名脓毒症患者和三名健康对照中提取了总RNA。RNA纯度通过Bioanalyzer 2100系统评估。根据制造商的协议，使用指定的试剂盒制备测序库。PCR产物通过AMPure XP系统（Beckman）进行纯化以确保高质量。库的质量通过Agilent Bioanalyzer 2100系统（Agilent，美国）进行验证。带有索引的库在适当的平台上进行聚类和测序，周期为150次。差异表达基因（DEGs）通过层次聚类和功能富集分析进行识别，设置阈值为|log? fold change| > 1和调整后的p值<0.05，以确保结果的稳健性和显著性。

为了诱导脓毒症相关的ALI，我们使用了CLP模型。男性C57BL/6小鼠（25-30克）从上海Slack实验动物公司（上海，中国）获得。脓毒症诱导的肝损伤通过CLP模型建立。小鼠被随机分配到四个实验组（每组n=6）：假手术组、CLP组、CLP+载体组和CLP+AKR1C3-IN-5组（10毫克/千克）。AKR1C3-IN-5按照制造商的说明配制成载体，包含10% DMSO、40% PEG300、5% Tween-80和45%生理盐水。载体对照组接受了相同的溶剂混合物。AKR1C3-IN-5（10毫克/千克）通过腹腔注射每日一次。所有小鼠在手术后72小时被安乐死，肝组织被收集用于后续分析。动物研究方案已获得赣南医学院第一附属医院伦理委员会的批准（批准号：IACUC-GNMU-2024-081），并按照ARRIVE指南进行。

肝组织的苏木精-伊红（H&E）和免疫组织化学（IHC）染色通过将肝组织小心分离并用4%多聚甲醛固定72小时进行。固定后，样本被包埋在石蜡中，并按照标准协议进行H&E染色和IHC分析。

小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和谷氨酸草酰乙酸转氨酶（AST）活性通过来自Abcam的商业检测套件进行测量。

为了进行靶向基因沉默，我们使用Ribobio（广州，中国）设计并合成AKR1C3特异性小干扰RNA（siRNA）。THLE-2细胞被种植在六孔板中，密度为每孔2×10?个细胞，并在24小时后使其贴壁。随后，使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，美国）进行转染，使用5μL 20mM非靶向siRNA或AKR1C3靶向siRNA（AKR1C3 #1和#2；补充表1提供序列）。为了模拟体外肝损伤，细胞被用500ng/mL脂多糖（LPS；Sigma，美国）处理24小时。

细胞活力检测使用CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8；Beyotime Biotechnology，上海，中国）进行，按照制造商的说明操作。简要来说，应用相应的处理后，细胞与每孔10μL CCK-8溶液孵育3小时。随后，使用微孔板读数器（PerkinElmer，美国）在450nm处测量吸光度。

焦亡的检测通过流式细胞术进行。处理后，THLE-2细胞被胰蛋白酶消化、收集并重悬于200μL结合缓冲液中。细胞随后与10μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶（PI）溶液在室温下黑暗中孵育15分钟。立即使用流式细胞仪分析焦亡水平。

透射电子显微镜（TEM）通过将细胞用2.5%戊二醛在4°C下固定2小时进行。样品制备按照先前描述的方法进行。图像使用透射电子显微镜（HITACHI HT 7800，HITACHI，日本）进行捕捉。

乳酸脱氢酶（LDH）释放测定使用LDH释放试剂盒（Beyotime Biotechnology，上海，中国）进行，按照制造商的协议操作。吸光度在490nm处记录。

在THLE-2细胞中检测活性氧（ROS）通过将细胞与10μM的红ox敏感荧光探针DCFH-DA（Beyotime Biotechnology，中国）在37°C下孵育20分钟进行。随后，使用荧光显微镜（Olympus Corp., Tokyo, Japan）观察DCF标记的细胞荧光。

酶联免疫吸附测定（ELISA）通过离心肝组织或细胞匀浆后收集上清液进行。上清液和标准样品被分装到ELISA板中，彻底混合并在37°C下孵育40分钟。板随后被彻底洗涤，依次加入初级抗体、酶标记抗体和底物工作液。最后加入终止液，使用微孔板读数器在450nm处测量吸光度。

Western blot分析通过使用RIPA缓冲液制备肝组织或细胞裂解液，并测定蛋白质浓度。对于每个样本，50μg蛋白质通过10% SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。膜在5%脱脂奶粉中封闭后，进行抗体孵育。使用的抗体包括：磷酸化的p65（1:1000，Proteintech Group，武汉，中国）、磷酸化的IκBα（1:1000，Proteintech Group）、TRAF6（1:1000，Proteintech Group）、GSDMD-N（1:1000，ABclonal Technology，武汉，中国）、Cleaved-caspase-1（1:1000，Abbkine）、NLRP3（1:1000，Proteintech Group）、ASC（1:1000，Affinity Biosciences，江苏，中国）和GAPDH（Boster Biological Technology，武汉，中国）。在室温下孵育1小时后，使用HRP标记的次级抗体（1:5000，Proteintech）进行检测。蛋白质条带通过ECL试剂盒（Beyotime）进行可视化。

免疫荧光共聚焦成像通过将细胞固定，并在4°C下与特异性抗体孵育进行。细胞随后用荧光标记的次级抗体（Abcam，剑桥，英国）在黑暗中孵育。细胞核用DAPI（Beyotime，上海，中国）进行复染。使用共聚焦激光扫描显微镜（Leica TCS SP8，Wetzlar，德国）进行高分辨率图像捕捉。

转录组测序通过在Illumina平台上进行，由Genechem Co., Ltd.（上海，中国）提供。总RNA从si-AKR1C3转染的THLE-2细胞中提取，使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（Cat. 9767，TaKaRa，日本）按照制造商的说明进行。RNA降解和污染通过1%琼脂糖凝胶评估，RNA纯度通过NanoPhotometer?分光光度计（IMPLEN，CA，美国）进行测量。RNA完整性通过Bioanalyzer 2100系统上的RNA Nano 6000 Assay Kit进行评估。测序库使用NEBNext? Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina?（NEB，美国）按照制造商的协议进行构建，并加入索引代码以分配序列到相应样本。为了识别DEGs，应用以下阈值：假发现率（FDR）≤0.03、调整后的p值（p_adj）≤0.05和绝对log?倍数变化（|log?FC|）≥1.0。在Gene Ontology（GO）富集和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析中，p值≤0.05的术语被认为是统计学显著的。

氧化产物和抗氧化剂的测定通过将每只肝脏的右叶在4°C下用PBS匀浆，并在10,000×g下离心10分钟去除不溶性碎片进行。使用来自南京建成生物工程研究所的商业检测套件（南京，中国）测量丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性。MDA和SOD的光密度分别在405nm和450nm处确定。

AKR1C3和TRAF6的分子对接通过从蛋白质数据库（PDB）中获取AKR1C3（PDB ID: 6A7B）和TRAF6（PDB ID: 5VNZ）的三维结构进行。使用HDOCK服务器进行蛋白质-蛋白质对接以生成复合结构模型。结果通过PyMOL软件（版本3.0.3）进行分析和可视化。

共免疫沉淀（Co-IP）实验通过在指定的预处理后准确测定蛋白质浓度进行。肝细胞使用混合缓冲液裂解以提取蛋白质样品。蛋白质上清液通过与兔多克隆IgG对照抗体和蛋白A/G加琼脂糖珠（Beyotime）孵育1小时进行预清除。然后，与抗AKR1C3抗体（Affinity Biosciences，1:1000）在4°C下孵育24小时。在与免疫沉淀缓冲液进行大量洗涤以去除非特异性结合后，免疫沉淀的复合物被重悬于SDS-PAGE加载缓冲液中并变性。随后，通过Co-IP分析蛋白质-蛋白质相互作用。

实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）通过使用Trizol试剂从细胞和肝组织中提取总RNA进行。在逆转录后，使用SYBR Green Master Mix在实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行定量实时PCR。GAPDH作为内源性对照用于标准化。所有引物由Sangon Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）合成。引物序列设计如下（5′→3′）：AKR1C3（人）：正向（TCTGGGATCTCAACGAGACAA），反向（TGGAACTCAAAAACCTGCACG）。GAPDH（人）：正向（TGTGGGCATCAATGGATTTGG），反向（ACACCATGTATTCCGGGTCAAT）。AKR1C3（小鼠）：正向（TAGGCCAGGCCATTCTAAGC），反向（CTCCATGGCCTTCAGAGACAC）。GAPDH（小鼠）：正向（AAGAGGGATGCTGCCCTTAC），反向（TACGGCCAAATCCGTTCACA）。

泛素化实验通过使用Pierce Classic Magnetic IP/Co-IP Kit（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的协议进行。随后，免疫沉淀的样品通过SDS-PAGE分离，并通过Western blot分析使用抗泛素抗体进行检测。

在统计分析部分，所有数据以均值±标准差（SD）表示，并使用GraphPad Prism软件（版本8.0）进行分析。两组之间的统计比较使用双尾不配对Student's t检验。多组比较使用单因素方差分析（ANOVA），并采用Tukey's post hoc检验进行配对比较。通过接收者操作特征（ROC）曲线分析评估血清AKR1C3水平在脓毒症诊断中的表现。计算曲线下面积（AUC）以评估AKR1C3在脓毒症患者与健康对照之间的区分能力。p值小于0.05被认为是统计学显著的。

研究结果部分，我们首先进行了转录组分析，比较了三名脓毒症患者和三名匹配的健康对照的血清样本。初步筛查发现AKR1C3在脓毒症中显著上调，其mRNA水平在患者中明显高于对照组。为了验证这一发现，我们在包括56名脓毒症患者和56名年龄匹配的健康个体的扩大队列中测量了血清AKR1C3蛋白浓度。与对照组相比，脓毒症患者显示出显著更高的AKR1C3水平。ROC曲线分析进一步支持了血清AKR1C3在脓毒症诊断中的潜力，显示出AUC为0.885。值得注意的是，脓毒症患者的血清AKR1C3水平与TNF-α、IL-6和IL-1β显示出正相关。为了探讨AKR1C3在脓毒症诱导的ALI中的作用，我们使用CLP建立了小鼠脓毒症模型。肝组织的组织学分析显示，CLP诱导的小鼠表现出严重的肝损伤，表现为局部肝细胞坏死和炎症细胞浸润。这些结构变化伴随着功能障碍，如与假手术对照相比，血清AST和ALT水平显著升高。脓毒症小鼠的肝组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平也显著升高。重要的是，脓毒症肝组织中的AKR1C3 mRNA和蛋白表达显著高于假手术动物。

为了评估AKR1C3抑制在脓毒症诱导的ALI中的治疗潜力，我们给脓毒症小鼠施用AKR1C3特异性抑制剂AKR1C3-IN-5（10毫克/千克）。Western blot分析确认了抑制剂处理的小鼠肝组织中AKR1C3蛋白表达的显著抑制。药理学抑制AKR1C3显著改善了脓毒症小鼠的生存率，抑制剂处理的小鼠表现出比CLP组更长的生存时间。生化评估显示，AKR1C3-IN-5显著减轻了脓毒症诱导的肝功能障碍，如抑制剂处理后血清AST和ALT水平的降低。同时，抑制剂治疗显著减少了肝组织中促炎性细胞因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的积累。组织病理学评估显示，AKR1C3-IN-5处理的小鼠肝组织结构得以保存，表现为肝细胞坏死减少和炎症细胞浸润减轻。为了进一步评估AKR1C3抑制对肝细胞增殖和再生的影响，我们进行了Ki67的免疫组化染色。如图所示，CLP组的肝脏中Ki67阳性核数量稀少，表明脓毒症小鼠的再生能力受到抑制。相比之下，AKR1C3-IN-5治疗显著增加了Ki67阳性肝细胞的数量，表明AKR1C3抑制可以恢复脓毒症诱导的损伤后的增殖活动。免疫组化染色确认了脓毒症肝组织中AKR1C3阳性表达的上调，这种上调在AKR1C3-IN-5治疗后得到有效降低。考虑到睾酮代谢主要在肝脏中进行，并转化为二氢睾酮，而AKR1C3在人类前列腺癌和癌前病变中高度表达，参与睾酮和5α-二氢睾酮（5α-DHT）等雄激素的合成，我们进一步评估了肝脏中的5α-DHT水平。ELISA结果表明，脓毒症小鼠的肝脏中5α-DHT水平显著高于假手术组，这一效应在AKR1C3-IN-5治疗后得到有效逆转。综上所述，这些结果表明AKR1C3在脓毒症期间在肝脏中高度表达且功能活跃，其抑制可以通过减少炎症反应、减轻氧化应激和保持肝细胞完整性来缓解脓毒症相关ALI。

AKR1C3-IN-5的抑制作用显著减少了脓毒症小鼠中促炎性细胞因子的产生，并改善了肝功能。此外，它显著减轻了肝组织的病理损伤，并减少了肝细胞焦亡。为了进一步评估AKR1C3抑制对肝细胞增殖和再生的影响，我们进行了Ki67的免疫组化染色。如图所示，CLP组的肝脏中Ki67阳性核数量稀少，表明脓毒症小鼠的再生能力受到抑制。相比之下，AKR1C3-IN-5治疗显著增加了Ki67阳性肝细胞的数量，表明AKR1C3抑制可以恢复脓毒症诱导的损伤后的增殖活动。免疫组化染色确认了脓毒症肝组织中AKR1C3阳性表达的上调，这种上调在AKR1C3-IN-5治疗后得到有效降低。考虑到睾酮代谢主要在肝脏中进行，并转化为二氢睾酮，而AKR1C3在人类前列腺癌和癌前病变中高度表达，参与睾酮和5α-二氢睾酮（5α-DHT）等雄激素的合成，我们进一步评估了肝脏中的5α-DHT水平。ELISA结果表明，脓毒症小鼠的肝脏中5α-DHT水平显著高于假手术组，这一效应在AKR1C3-IN-5治疗后得到有效逆转。综上所述，这些结果表明AKR1C3在脓毒症期间在肝脏中高度表达且功能活跃，其抑制可以通过减少炎症反应、减轻氧化应激和保持肝细胞完整性来缓解脓毒症相关ALI。

为了在体外建立脓毒症模型，我们将正常的HLE-2细胞暴露于LPS中以诱导细胞损伤。剂量和时间反应分析确定了500ng/mL LPS处理24小时作为AKR1C3蛋白表达最大上调的条件。siRNA介导的AKR1C3沉默（图3A–B和补充图4A–B）显著减少了LPS诱导的细胞活力和增殖受损。这一效果在使用AKR1C3-IN-5进行药理学抑制时也得到了镜像。为了分解特定细胞死亡途径的贡献，我们使用了选择性诱导铁死亡（RSL3）、焦亡（尼格瑞辛）和自噬（奥拉帕利）的诱导剂。焦亡的诱导具体消除了AKR1C3沉默的细胞保护作用。为了进一步排除si-AKR1C3对LPS诱导的THLE-2细胞自噬的潜在影响，我们进行了GFP-LC3免疫荧光染色和LC3表达的Western blot分析。结果表明，si-AKR1C3对这些指标没有抑制作用（补充图4D–E），进一步支持了si-AKR1C3在LPS处理后不调节THLE-2细胞的自噬水平。同时，AKR1C3沉默显著减轻了LPS触发的肝细胞焦亡。此外，AKR1C3沉默减少了LPS诱导的THLE-2细胞中LDH的释放。TEM确认了AKR1C3沉默减轻了LPS刺激的THLE-2细胞中线粒体超微结构损伤——这是焦亡的标志性特征。体内验证显示，AKR1C3-IN-5治疗抑制了脓毒症小鼠肝脏中关键焦亡标志物（GSDMD-N、Cleaved-caspase-1、NLRP3和ASC）的表达，同时减轻了氧化应激，如MDA水平的降低和SOD活性的恢复。这些协调的结果表明，AKR1C3的抑制通过双重调节焦亡细胞死亡和氧化稳态，为脓毒症相关肝损伤提供了保护。

为了评估AKR1C3沉默对THLE-2细胞中焦亡的影响，我们进行了RNA测序，比较了si-AKR1C3转染的细胞与对照细胞。分析识别出130个差异表达基因（DEGs），包括27个下调基因和103个上调基因，通过层次聚类和火山图分析可视化。KEGG通路富集分析表明，AKR1C3的抑制显著改变了NF-κB信号通路。GO注释进一步揭示了DEGs在与焦亡相关的生物过程中的主要富集，这与NF-κB在炎性小体激活中的已知作用一致。在LPS刺激的THLE-2细胞中，机制研究显示AKR1C3沉默抑制了IκBα和p65的磷酸化——这些是NF-κB激活的关键调节因子。免疫荧光分析确认了p65核转位的减少。这些发现得到了体内实验的支持，其中使用AKR1C3-IN-5进行药理学抑制也显著减少了脓毒症小鼠肝脏中IκBα和p65的磷酸化。这些整合的转录组和功能结果确定了AKR1C3作为脓毒症相关肝病理生理学中NF-κB/焦亡轴的重要上游调节因子。

为了阐明NF-κB如何在AKR1C3依赖性抑制焦亡中发挥作用，我们用NF-κB激动剂佛波酯12-肉豆蔻酸13-醋酸酯（PMA）（10nM）处理LPS挑战的THLE-2肝细胞。药理学激活NF-κB通过PMA有效地逆转了AKR1C3沉默的保护作用，如与si-AKR1C3单独处理的细胞相比，细胞活力和增殖能力显著降低。与这些结果一致，PMA共处理恢复了AKR1C3沉默细胞中焦亡标志物（GSDMD-N、Cleaved-caspase-1、NLRP3和ASC）的表达至对照水平。细胞内ROS积累——焦亡信号的标志性特征——在AKR1C3抑制后显著减少，这一减少在PMA共处理后被部分逆转。流式细胞术分析确认了AKR1C3沉默显著降低了THLE-2细胞的焦亡，这一效应在PMA治疗后被逆转。此外，si-AKR1C3在LPS刺激的肝细胞中对IL-1β、IL-6和TNF-α的抑制作用在PMA共处理后部分被抵消。这些协调的结果表明，AKR1C3抑制的抗焦亡效应在机制上依赖于NF-κB通路的失活。

为了探讨AKR1C3如何通过调节TRAF6来影响NF-κB活性，我们处理了LPS挑战的THLE-2肝细胞，并检查了AKR1C3沉默对TRAF6表达的影响。如图6A和补充图7所示，AKR1C3的沉默提高了THLE-2细胞中TRAF6的蛋白水平。Co-IP实验确认了AKR1C3与TRAF6在THLE-2细胞中的物理相互作用。分子对接分析进一步支持了这一相互作用，显示出AKR1C3和TRAF6之间有利的结合自由能（?195.75 kcal/mol）。预测的结合模式表明，AKR1C3中的残基Glu28、Ser32、Ser129、Thr131、Asn134和Arg226与TRAF6中的Lys68、Cys86、Arg89、Arg126、Glu127、Arg147和Gln148形成氢键。此外，AKR1C3中的Leu128、Gly135和Trp227与TRAF6中的Phe119和Phe123之间观察到了疏水相互作用。为了进一步验证这一相互作用，我们在共转染AKR1C3和TRAF6表达载体的HEK293T细胞中进行了Co-IP实验。结果清楚地表明，AKR1C3与TRAF6共沉淀。体外GST pull-down实验进一步确认了AKR1C3和TRAF6在没有其他细胞因子的情况下直接结合。免疫荧光染色也显示了AKR1C3和TRAF6在THLE-2细胞中的显著共定位。为了进一步探讨AKR1C3对TRAF6稳定性的影响，我们使用蛋白质合成抑制剂CHX或蛋白酶体抑制剂MG132处理AKR1C3沉默的细胞。在CHX处理后，AKR1C3沉默的细胞中TRAF6蛋白表达显著高于对照组。此外，MG132处理提高了TRAF6水平，而AKR1C3沉默进一步增强了TRAF6的积累。与这些发现一致，AKR1C3-IN-5处理破坏了AKR1C3与TRAF6的相互作用，并提高了TRAF6蛋白稳定性。鉴于TRAF6作为E3泛素连接酶的功能，并通过自泛素化激活NF-κB，我们检查了AKR1C3是否调节这一过程。THLE-2细胞中AKR1C3的下调显著抑制了TRAF6的泛素化，表明AKR1C3促进了TRAF6的泛素化，从而促进了NF-κB的激活。我们进一步研究了CLP诱导的脓毒症小鼠肝组织中TRAF6的表达。结果显示，脓毒症小鼠的TRAF6蛋白水平显著降低。更重要的是，在脓毒症小鼠的肝组织中观察到TRAF6与AKR1C3表达水平之间存在显著的负相关。

在讨论部分，我们探讨了AKR1C3在脓毒症诱导的ALI中的作用机制。TRAF6是NF-κB通路中的关键信号蛋白。为了研究AKR1C3抑制是否通过调节TRAF6来失活NF-κB，我们检查了AKR1C3沉默对TRAF6表达的影响。如图6A和补充图7所示，AKR1C3的沉默提高了THLE-2细胞中TRAF6的蛋白水平。Co-IP实验确认了AKR1C3与TRAF6在THLE-2细胞中的物理相互作用。分子对接分析进一步支持了这一相互作用，显示出AKR1C3和TRAF6之间有利的结合自由能（?195.75 kcal/mol）。预测的结合模式表明，AKR1C3中的残基Glu28、Ser32、Ser129、Thr131、Asn134和Arg226与TRAF6中的Lys68、Cys86、Arg89、Arg126、Glu127、Arg147和Gln148形成氢键。此外，AKR1C3中的Leu128、Gly135和Trp227与TRAF6中的Phe119和Phe123之间观察到了疏水相互作用。为了进一步验证这一相互作用，我们在共转染AKR1C3和TRAF6表达载体的HEK293T细胞中进行了Co-IP实验。结果清楚地表明，AKR1C3与TRAF6共沉淀。体外GST pull-down实验进一步确认了AKR1C3和TRAF6在没有其他细胞因子的情况下直接结合。免疫荧光染色也显示了AKR1C3和TRAF6在THLE-2细胞中的显著共定位。为了进一步探讨AKR1C3对TRAF6稳定性的影响，我们使用蛋白质合成抑制剂CHX或蛋白酶体抑制剂MG132处理AKR1C3沉默的细胞。在CHX处理后，AKR1C3沉默的细胞中TRAF6蛋白表达显著高于对照组。此外，MG132处理提高了TRAF6水平，而AKR1C3沉默进一步增强了TRAF6的积累。与这些发现一致，AKR1C3-IN-5处理破坏了AKR1C3与TRAF6的相互作用，并提高了TRAF6蛋白稳定性。鉴于TRAF6作为E3泛素连接酶的功能，并通过自泛素化激活NF-κB，我们检查了AKR1C3是否调节这一过程。THLE-2细胞中AKR1C3的下调显著抑制了TRAF6的泛素化，表明AKR1C3促进了TRAF6的泛素化，从而促进了NF-κB的激活。我们进一步研究了CLP诱导的脓毒症小鼠肝组织中TRAF6的表达。结果显示，脓毒症小鼠的TRAF6蛋白水平显著降低。更重要的是，在脓毒症小鼠的肝组织中观察到TRAF6与AKR1C3表达水平之间存在显著的负相关。

尽管我们的研究提供了AKR1C3与TRAF6相互作用的初步验证，但我们认识到需要以更动态和生物物理详细的方式定量表征这种结合。因此，我们计划在后续工作中使用表面等离子体共振（SPR）技术进一步研究这种相互作用。SPR将允许我们获得实时、无标记的结合动力学数据，包括AKR1C3与TRAF6之间的结合亲和力（KD）、结合速率（kon）和解离速率（koff）。在由CLP或全身LPS诱导的脓毒症动物模型中，自噬已被证明在多种细胞和器官的激活和/或损伤中起作用，包括免疫细胞、心脏、肺、肾脏和肝脏。之前由Gao等人进行的研究表明，AKR1C3沉默可以诱导甲状腺癌细胞中的自噬。然而，在我们的实验系统中，我们并未观察到AKR1C3对LPS诱导的自噬的调节作用。在未来的实验中，我们计划进一步探讨在脓毒症诱导的肝损伤小鼠模型中自噬的关键基因。

本研究的主要结论是，AKR1C3在脓毒症小鼠的肝脏和脓毒症患者的血清中显著上调。在正常的人类肝细胞（THLE-2细胞）中，AKR1C3的抑制减轻了LPS诱导的炎症和焦亡。在体内，AKR1C3-IN-5的药理学抑制减轻了脓毒症诱导的肝损伤，如血清转氨酶水平（AST和ALT）的降低、促炎性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的减少以及焦亡标志物（NLRP3、ASC、GSDMD-N和Cleaved-caspase-1）的下调。此外，AKR1C3-IN-5的治疗显著降低了脓毒症小鼠肝脏中的GSDMD-N表达，而PMA治疗则逆转了这一效应。AKR1C3-IN-5（10毫克/千克）在健康小鼠中的安全性评估显示，主要器官中没有明显的组织病理学变化，表明其良好的生物相容性。这些结果表明，AKR1C3的抑制主要通过失活NF-κB通路来减轻脓毒症相关ALI，突显了其在管理危重疾病中的治疗潜力。