C1q与甘露糖结合凝集素在遗传多样性结核分枝杆菌复合群菌株中的结合模式及补体激活作用研究

《The Journal of Immunology》：C1q and mannose-binding lectin binding and complement activation across genetically diverse Mycobacterium tuberculosis complex strains

本研究针对结核分枝杆菌复合群（MTBC）菌株遗传多样性对补体系统激活机制的影响这一关键科学问题，通过系统分析22种临床菌株与补体模式识别分子的相互作用，首次揭示C1q作为天然免疫识别分子直接结合MTBC菌株的重要现象。研究发现虽然C1q和MBL均能激活补体级联反应（包括C4b/C3b沉积和MAC形成），但C1q在非免疫血清中起主导作用，MBL仅发挥辅助功能。值得注意的是，尽管观察到明显的MAC形成，该过程并未显著影响细菌存活，这一发现为理解结核病早期宿主-病原体相互作用提供了新的视角。

　　

结核病（TB）至今仍是全球最致命的传染病之一，2023年世界卫生组织记录的新增病例高达820万，死亡人数达到125万。这种疾病的元凶——结核分枝杆菌复合群（MTBC）包含结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和坎氏分枝杆菌等多个物种，其基因组多样性显著影响着病原体与宿主的相互作用、免疫逃逸策略以及疾病结局。尽管补体系统作为天然免疫的关键组成部分，在病原体识别和免疫调节中发挥双重作用，但其与MTBC菌株的相互作用机制长期以来缺乏系统研究。

补体系统的三条激活途径——经典途径（CP）、凝集素途径（LP）和替代途径（AP）——通过不同机制启动免疫应答。经典途径通常由C1q识别抗体复合物触发，凝集素途径则由甘露糖结合凝集素（MBL）、ficolin-1/2/3等模式识别分子启动，而替代途径则具有自发激活特性并能放大前两条途径的效应。补体激活的主要功能包括通过C3b等蛋白促进靶细胞吞噬、通过膜攻击复合物（MAC）介导细胞裂解，以及通过过敏毒素C3a和C5a驱动炎症反应。

然而，现有关于补体系统与分枝杆菌相互作用的研究大多局限于实验室适应株（如H37Rv、Erdman株或卡介苗BCG），这些菌株与临床实际分离株存在显著差异。特别值得注意的是，不同MTBC谱系在巨噬细胞内生长能力、小鼠模型中的毒力表现、药物耐药性进化等方面均存在明显差异，这表明遗传变异直接影响着分枝杆菌与宿主识别系统的相互作用。

为了填补这一知识空白，本研究团队开展了一项系统性的实验研究，旨在阐明补体系统与代表性MTBC临床菌株之间的相互作用机制。研究特别关注C1q和MBL这两种关键模式识别分子在不同遗传背景MTBC菌株表面的结合特性，及其对补体激活级联的影响。

研究人员首先建立了包含22种临床菌株的实验体系，这些菌株覆盖了MTBC的六个主要谱系：全球分布的L2（东亚型）、L3（德里/CAS型）、L4（欧洲-美洲型）以及地理局限的L1（东非印度型）、L5（西非1型）和L6（西非2型）。通过全基因组测序数据构建的系统发育树清晰展示了这些菌株的遗传关系。

关键技术方法包括：基于全基因组测数据的系统发育分析（7476个SNP位点）、流式细胞术检测补体蛋白结合与激活、补体途径特异性抑制实验（使用抗MBL单克隆抗体3F8、抗C1q单克隆抗体CLB/C1q85和C3抑制剂compstatin CP40）、以及血清杀菌实验评估细菌存活率。所有临床菌株均经过γ射线灭活处理，确保实验生物安全性。

结合补体蛋白到MTBC临床菌株

研究人员首先筛选了多种补体模式识别分子（PRMs）与不同谱系MTBC菌株的结合能力。结果显示，重组MBL（rMBL）、重组ficolin-2（rficolin-2）和纯化C1q（pC1q）能够显著结合到研究的MTBC菌株上。

MBL能够识别所有测试菌株，但结合程度存在谱系间差异，其中L2（178/03）和L6（10476/01）菌株的结合水平最低。Ficolin-2主要结合L1、L3、L4S谱系菌株和H37Rv参考株。尤为重要的是，研究发现C1q能够直接结合MTBC临床菌株，在L1、L3、L4S谱系和H37Rv上观察到最高结合水平。其他测试的模式识别分子和MASP-1/-3仅表现出微弱的结合能力。

MTBC菌株中MBL和C1q的差异结合

通过扩大临床菌株数量，研究人员进一步验证了MBL和C1q的结合特性。rMBL能够结合所有测试的L1-L6谱系菌株和H37Rv，其中对178/03（L2）的结合水平最低。

pC1q的结合则表现出更大的菌株间变异。一个L2谱系菌株和一个L5谱系菌株几乎不结合pC1q，而L3和L4S谱系内部则同时存在高结合和低结合菌株。所有非洲分枝杆菌L5和L6谱系菌株均检测到相对较低的pC1q结合水平，但这些菌株均能被rMBL清晰识别，表明MBL结合的菌株间变异性小于C1q。

通过CP和LP由MTBC主要谱系激活补体

在观察到MBL和C1q与不同MTBC谱系菌株结合后，研究人员进一步研究了补体系统的激活情况以及各途径的贡献。通过使用2%正常人类血清（NHS）来降低替代途径活性，他们检测了细菌表面C3b沉积和C5b-9 MAC形成。

所有研究的结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌菌株均能激活补体级联反应，但不同谱系间存在一定变异。值得注意的是，在存在MBL抑制剂的情况下仍能观察到C3b沉积和MAC形成，表明在没有凝集素途径激活的情况下补体仍能被激活。相反，C1q抑制显著降低了大多数研究菌株的C3b沉积和MAC形成，提示这种模式识别分子在补体级联激活中具有不可替代的功能。尽管MBL在补体激活中的作用似乎不显著，但同时抑制MBL和C1q完全消除了补体活性。

通过AP由MTBC谱系激活补体

为了研究替代途径完全参与下的补体激活情况，研究人员采用了相同的策略，但使用10%而非2%的NHS。在10% NHS存在下，所有研究菌株均检测到C3b和MAC，这证实了不同MTBC谱系能够激活补体级联的结论。

与之前实验类似，MBL抑制不影响C3b沉积和MAC形成。在10% NHS中，C1q和MBL共同抑制仅完全降低了两个测试菌株（2383/12和5400/02）的C3b和MAC水平，这与2% NHS中所有菌株沉积均受抑制的情况形成对比。在10% NHS中，C3b水平受影响最大的菌株是那些基线C3b水平最低的菌株，这些也是共同抑制最显著降低C4b的菌株。

血清对分枝杆菌存活的影响

尽管在MTBC菌株表面观察到了MAC形成，研究人员进一步探讨了NHS存在是否影响临床菌株的存活率。通过将活分枝杆菌与来自已知BCG疫苗接种状态队列的不同浓度NHS一起孵育，基于后续平板培养和菌落形成单位（CFU）计数评估对存活率的影响。

研究的广泛NHS浓度范围并未改变结核分枝杆菌菌株1797/03（L1）、178/03（L2）、2383/12（L3）、2336/02（L4G）、5400/02（L4S）和H37Rv以及非洲分枝杆菌菌株1449/02和10415/02（L5）的CFU计数，表明血清不影响MTBC菌株的存活率。

讨论与结论

本研究首次提供了关于补体系统与代表全球病原体多样性的多种临床MTBC菌株相互作用的系统性数据。研究发现虽然不同MTBC谱系菌株普遍能够激活补体系统，但存在菌株间变异。特别重要的是，C1q作为天然免疫识别分子直接结合多种MTBC临床菌株表面，表明这种补体模式识别分子在结核病中可能具有尚未知的功能。

研究结果表明，补体激活程度因菌株而异，且在10% NHS中的C3b值总体低于2% NHS，这可能暗示补体调节蛋白在高血清浓度下在分枝杆菌表面发挥作用。C1q和MBL在10% NHS中的共同抑制仅消除了少数菌株的C3b和MAC，这些菌株主要在上游C4b水平受影响，可能是因为低C4b基线水平。这表明替代途径放大环有助于MTBC上的总补体激活。

尽管本研究未观察到补体对MTBC菌株存活率的显著影响，但研究人员指出，这并不排除补体识别对专业吞噬细胞摄取和细胞内存活的影响。未来的研究需要探讨C1q和MBL识别对病原体还是宿主有利的问题。

值得注意的是，实验设计中使用的血清条件可能无法准确反映肺泡环境中补体与分枝杆菌的局部相互作用，可能低估了替代途径在体内的贡献。然而，研究结果与先前的工作一致，表明C3和C1q对于支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌上的补体激活至关重要。

这项研究强调了评估多样化MTBC临床菌株组对于全面评估补体激活在结核病中作用的重要性。通过使用具有广泛毒力范围的MTBC菌株分析结核病背景下的补体激活，可以得出结论：MTBC细菌通常能够激活补体系统，且菌株间存在一定变异。特别值得注意的是，C1q作为MTBC表面的天然免疫模式识别分子发挥作用，表明这种补体PRM在结核病中可能具有尚未知的作用。这些发现为理解结核病早期宿主-病原体相互作用提供了新的理论基础，并为未来研究补体系统在结核病发病机制中的具体作用机制指明了方向。