基于太空受限水凝胶颗粒的生物传感器，通过快速无标记荧光检测aflD基因来实现黄曲霉素B1的早期预警

《Analytical Chemistry》：Space-Confined Hydrogel Particle-Based Biosensor for Early Warning of Aflatoxin B1 via Rapid Label-Free Fluorescence Detection of the aflD Gene

黄曲霉毒素B1（AFB1）的早期预警依赖aflD基因检测。本研究开发了一种基于空间限制的水凝胶微球阵列平台，通过聚乙二醇羧酸酯（PEG–COOH）水凝胶的微结构将目标基因富集于外层水相，结合石墨烯氧化物（GO）抑制背景荧光干扰，并采用新型V型双阳离子荧光探针（VLM）实现特异性检测。该方法检测限低至19.05 nM，线性范围50–1000 nM，检测时间仅需15秒，较传统方法提速240倍，适用于食品链中AFB1污染的快速现场筛查。

　　近年来，随着食品安全问题日益受到关注，对食品中潜在有害物质的快速、灵敏检测成为科研领域的重点。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）因其强烈的致癌性、肝毒性和致突变性，被公认为全球公共卫生的重大威胁之一。AFB1主要由黄曲霉属真菌产生，其污染可能导致严重的健康风险，尤其是在粮食和饲料中。因此，早期识别AFB1的产生机制，如检测其生物合成相关基因，成为预防污染的重要手段。

在传统的AFB1检测方法中，色谱和质谱技术虽然具有较高的准确性，但往往需要复杂的仪器设备和较长的检测时间，难以满足现场快速检测的需求。为了解决这些问题，研究者们开始探索基于分子识别的新型生物传感器技术。这些方法，如基于抗体的免疫传感器和基于适配体的适配体传感器，因其操作简便、灵敏度高和选择性好而受到青睐。然而，它们通常是在AFB1污染发生后才进行检测，无法在污染前提供预警，从而导致经济损失和供应链中断。

为了实现更早的污染预警，研究人员将目光投向了AFB1的分子前体，尤其是其生物合成基因。AFB1的生物合成涉及大约25到30种基因，这些基因通常聚集在一个约70到75千碱基（kb）的区域，编码一系列参与毒素合成的酶。在这些基因中，aflD基因在调控AFB1生物合成过程中起着关键作用。因此，对aflD基因的早期检测可以有效防止AFB1的过量积累，从而降低其对食品和饲料的污染风险。

传统的aflD基因检测方法，如聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR），虽然在灵敏度和准确性方面表现优异，但它们通常需要较长的检测时间、复杂的设备以及专业的操作技能，限制了其在现场快速检测中的应用。近年来，荧光生物传感器因其操作简便、灵敏度高和选择性好而成为研究热点。例如，李课题组开发了一种基于F?rster共振能量转移（FRET）原理的均相生物传感器，通过将CdTe/CdS量子点（QDs）和金纳米颗粒（AuNPs）分别连接到氨基修饰和硫醇修饰的发夹DNA探针上，实现了对aflD基因的高灵敏度检测。类似地，羧基功能化的CdTe QDs和石墨烯量子点（GQDs）也被用作荧光标记物，结合氨基修饰的单链DNA（ssDNA）用于构建分离无须、磁控的生物传感器。

尽管荧光生物传感器在AFB1早期预警方面展现出巨大潜力，但其在实际应用中仍面临一些挑战。首先，传统方法依赖于对ssDNA探针的功能基团修饰，这不仅增加了检测成本，也延长了制备时间。其次，目标ssDNA在溶液中的无序扩散导致分子识别效率低下，进而延长了检测时间。为了克服这些限制，研究者们开始借鉴自然界中的空间限制机制，开发新型的生物传感平台。

本研究提出了一种基于空间限制机制的水凝胶微粒阵列生物传感器，用于aflD基因的快速、无标记荧光检测，从而实现对AFB1污染的早期预警。该平台利用聚乙二醇羧酸（PEG–COOH）水凝胶微粒的外层水溶液来限制反应物的扩散，从而在局部区域提高aflD基因的浓度，显著加速了反应动力学。通过将石墨烯氧化物（GO）引入系统，可以有效减少背景干扰，提高检测的特异性。此外，采用了一种新合成的V形二阳离子荧光探针（VLM），该探针能够特异性地结合双链DNA（dsDNA），并在结合时表现出显著的荧光增强效果。

该生物传感器的检测限达到19.05 nM，检测范围为50–1000 nM，并且仅需15秒即可完成检测，比传统方法快了240倍。其优异的灵敏度和特异性使其成为现场实时监测和早期预警的理想工具。该平台的成功应用不仅克服了传统基因检测方法的局限性，还为食品安全、环境监测和即时诊断提供了新的解决方案。

在实验部分，首先合成了GO，通过Hummer法进行氧化处理，得到了具有高比表面积和层状结构的GO纳米片。随后，制备了具有超亲水特性的微芯片，通过酸催化硅溶胶（ACSS）与玻璃基底的结合，形成了对比的超疏水表面。这种表面结构能够精确地限制溶液在微孔中的扩散，从而为后续的检测提供理想的微环境。

接着，通过将PEG二丙烯酸酯（PEG DA）和PEG羧酸（PEG–COOH）混合，制备了具有特定孔径和表面电荷的水凝胶微粒阵列。这种微粒结构能够有效地将目标DNA分子限制在外层水溶液中，提高其局部浓度，从而加速DNA杂交反应。实验结果表明，负电荷的PEG–COOH水凝胶微粒能够有效捕获并富集aflD基因，提高检测的效率和灵敏度。

在性能评估方面，该生物传感器表现出优异的检测性能。通过激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）对不同浓度的aflD基因进行检测，结果显示荧光强度随浓度增加而增强，且检测信号具有良好的重复性和线性关系。检测限为19.05 nM，线性范围为50–1000 nM，相关系数高达0.998。此外，该平台在检测aflD基因时，仅需15秒即可完成，显著优于传统方法。

为了验证该生物传感器的特异性，对其对不同目标序列的响应进行了测试。结果显示，该传感器对aflD基因表现出显著的荧光增强，而对单碱基错配（MT1）、双碱基错配（MT2）和随机ssDNA序列的响应则明显较低，表明其具有较高的选择性。此外，该传感器在玉米粉等实际样品中的应用也证明了其在复杂基质中的抗干扰能力，能够有效检测aflD基因，为食品安全监测提供了有力支持。

与其他报道的荧光生物传感器相比，本研究的平台在检测速度和灵敏度方面具有明显优势。例如，基于FRET的生物传感器需要60分钟，而基于适配体的传感器需要80分钟，相比之下，本平台仅需15秒即可完成检测。尽管其他方法可能在检测限上表现更优，但它们通常需要多步骤的标记过程，增加了操作复杂性和成本。相比之下，本平台的无标记设计和简便操作使其在快速、现场检测中更具优势。

从实际应用的角度来看，该生物传感器的开发为食品安全提供了新的解决方案。它能够在污染发生前进行预警，从而减少经济损失和供应链中断。此外，该平台的便携性和快速响应能力使其适用于现场检测，为食品安全、环境监测和即时诊断提供了重要的工具。

未来的研究方向可以包括进一步优化VLM探针的性能，以提高检测灵敏度，同时探索该平台在其他黄曲霉毒素生物合成基因中的应用，扩大其诊断范围。此外，研究VLM与更高阶DNA结构（如三链和四链结构）的相互作用，有助于更深入地理解其DNA识别机制，并为设计更高效、更特异的生物传感器提供理论依据。这些研究不仅能够推动生物传感器技术的发展，还能为食品安全和公共健康提供更加可靠的保障。