TRPC和ORAI介导的钙内流对1-[2-(4-甲氧基苯基)-2-[3-(4-甲氧基苯基)丙氧基]乙基]咪唑氯化物（SKF-96365）的差异敏感性

《ACS Pharmacology & Translational Science》：Differential Sensitivity of TRPC- and ORAI-Mediated Calcium Entries to 1-[2-(4-Methoxyphenyl)-2-[3-(4-methoxyphenyl)propoxy]ethyl]imidazole Chloride (SKF-96365)

钙通道选择性抑制剂SKF-96365通过抑制ORAI1/STIM1复合体介导的SOCE和ROCE（IC50约4-5 μM），但对TRPC3/6/7通道抑制较弱（IC50>100 μM）。研究证实SKF-96365优先作用于ORAI通道，GSK-7975A进一步验证其特异性。

　　SKF-96365是一种被广泛用于研究钙离子进入机制的药物，它最初被识别为受体操作性钙离子进入（ROCE）的阻断剂，后来被发现也能够抑制由ORAI1和STIM1介导的储存操作性钙离子进入（SOCE）。尽管其作用机制已被广泛探讨，但关于SKF-96365对TRPC通道和ORAI通道的选择性仍然存在不确定性。为了更深入地理解其作用特性，研究人员采用了一系列实验手段，包括在不同细胞类型中评估其对SOCE和ROCE的抑制效果，以及通过基因敲除技术验证其是否具有选择性阻断TRPC通道的能力。

在实验设计中，研究者使用了TRPC七重敲除（hepta-KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和HEK293细胞，这些细胞分别表达了TRPC3、TRPC6或TRPC7通道。通过比较SKF-96365在这些细胞类型中的抑制效果，研究人员发现其对由Tg（硫苷甘醇）诱导的SOCE具有显著的抑制作用，且在TRPC hepta-KO细胞中也表现出类似的抑制效果。这表明SKF-96365对SOCE的抑制并不依赖于TRPC通道的存在，从而支持其主要作用于ORAI通道的结论。相比之下，SKF-96365对OAG（1-油酰-2-乙酰-sn-甘油）激活的TRPC通道介导的钙离子进入仅表现出较弱的抑制效果，且所需的抑制浓度远高于对SOCE的抑制浓度。这一发现进一步证明了SKF-96365对TRPC通道的选择性较低，而对ORAI通道具有更高的敏感性。

此外，为了进一步验证SKF-96365对ORAI通道的特异性，研究者在MEFs中过表达ORAI1、ORAI2或ORAI3，并观察其对SOCE的影响。结果显示，SKF-96365能够有效抑制由ORAI1和STIM1共表达诱导的SOCE，而对OAG激活的TRPC通道介导的钙离子进入则无明显影响。这一结果表明，ORAI通道在SKF-96365的作用机制中占据主导地位，而TRPC通道则不参与该药物的抑制作用。为了进一步确认这一点，研究者还测试了另一种特异性CRAC通道阻断剂GSK-7975A，该药物能够完全抑制Tg诱导的SOCE，但对OAG激活的TRPC通道无影响，进一步支持了SKF-96365主要作用于ORAI通道的观点。

研究还发现，SKF-96365在不同细胞类型中的抑制效果存在差异。例如，在TRPC hepta-KO MEFs中，其对SOCE的抑制效果与在野生型细胞中相似，这表明TRPC通道并非SOCE的主要成分。同时，TRPC hepta-KO细胞中SOCE的表达水平与野生型细胞基本一致，进一步支持了这一结论。相比之下，SKF-96365对TRPC通道的抑制效果则较为有限，即使在较高浓度下（如256 μM），也未能完全阻断OAG激活的钙离子进入，这可能与TRPC通道的激活机制不同有关。OAG作为DAG的膜渗透性类似物，能够直接激活TRPC通道，但不会引起内质网（ER）钙离子释放或STIM1的聚集，因此不会影响CRAC通道的形成。这表明TRPC通道的激活与SOCE机制是相互独立的，SKF-96365对TRPC通道的抑制效果较弱，可能是由于其作用机制并不完全针对这些通道。

在钙离子成像实验中，研究人员使用Fura-2AM作为钙离子探针，通过测量340/380 nm的荧光比值来评估细胞内钙离子浓度的变化。实验结果显示，SKF-96365在5 μM浓度下能够显著抑制Tg诱导的SOCE，而在OAG激活的TRPC通道介导的钙离子进入中则效果有限。这一发现表明，SKF-96365在抑制钙离子进入方面具有显著的选择性，尤其是在SOCE和ROCE的抑制上表现突出。然而，在较高浓度下，SKF-96365可能会影响其他非目标通道，如TRPC6和TRPC7，这可能是由于其在高浓度下的非特异性作用。因此，在使用SKF-96365进行钙离子进入研究时，需要特别注意其浓度依赖性，以避免误判其对不同钙离子通道的抑制效果。

此外，研究还涉及了多种细胞类型，包括小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BM-DMs）、HEK293细胞和胚胎心肌细胞。这些细胞在钙离子进入机制上存在差异，但SKF-96365在所有细胞类型中均表现出对SOCE的有效抑制。这一现象可能与不同细胞类型中ORAI和STIM蛋白的表达水平有关。例如，在TRPC hepta-KO细胞中，ORAI1、ORAI2、ORAI3以及STIM1和STIM2的表达水平与野生型细胞相似，这可能解释了为何SKF-96365在这些细胞中仍能有效抑制SOCE。然而，在某些细胞类型中，如HEK293细胞，ORAI3的表达水平较高，而SKF-96365对其抑制效果相对较弱，这可能与ORAI3的结构或功能特性有关。

研究还探讨了SKF-96365对不同钙离子通道的相对抑制效果。例如，在TRPC hepta-KO MEFs中，SKF-96365对SOCE的抑制效果与在野生型细胞中相当，这表明TRPC通道在SOCE中的作用有限。而对OAG激活的TRPC通道介导的钙离子进入，SKF-96365的抑制效果则较弱，且所需浓度远高于对SOCE的抑制浓度。这进一步支持了SKF-96365对ORAI通道具有更高的选择性和敏感性。相比之下，GSK-7975A则能够完全抑制SOCE和ROCE，表明其在选择性阻断ORAI通道方面更为有效。

在实验过程中，研究人员采用了多种方法，包括定量PCR（qPCR）分析、钙离子成像和电生理实验。这些方法共同揭示了SKF-96365在不同钙离子通道上的作用机制。例如，qPCR结果显示，TRPC hepta-KO细胞中ORAI和STIM蛋白的表达水平与野生型细胞相似，这表明TRPC通道的缺失并未显著影响ORAI通道的表达或功能。同时，钙离子成像实验表明，SKF-96365在低浓度下（如5 μM）能够有效抑制SOCE，而在较高浓度下则可能对其他通道产生非特异性影响。

此外，研究还发现，SKF-96365在不同细胞类型中的抑制效果存在差异。例如，在HEK293细胞中，SKF-96365对OAG激活的TRPC通道介导的钙离子进入的抑制效果较弱，而在TRPC hepta-KO MEFs中则表现出较强的抑制作用。这可能与不同细胞类型中ORAI和TRPC通道的表达水平、功能特性以及相互作用有关。例如，ORAI1在某些细胞中可能与其他ORAI亚型（如ORAI2和ORAI3）形成异源通道，从而影响SKF-96365的抑制效果。因此，在不同细胞类型中，SKF-96365的抑制效果可能受到多种因素的影响，包括细胞类型、通道表达水平以及实验条件。

总的来说，这项研究为SKF-96365在钙离子进入机制中的作用提供了新的见解。研究结果表明，SKF-96365对ORAI通道的抑制效果显著优于对TRPC通道的抑制效果，这一特性使其成为研究SOCE和ROCE机制的重要工具。然而，研究也指出，在较高浓度下，SKF-96365可能对其他通道产生非特异性影响，因此在使用该药物进行相关研究时，需要考虑其浓度依赖性。此外，研究还强调了在钙离子信号研究中，对SKF-96365的使用应更加谨慎，以避免因浓度不当而导致的误判。这些发现不仅有助于更准确地理解SKF-96365的药理特性，也为相关疾病的治疗策略提供了理论依据。