氨基糖苷类-肽核酸（PNA）复合物用于对抗革兰氏阴性菌

《Bioconjugate Chemistry》：Aminoglycoside–Peptide Nucleic Acid (PNA) Conjugates against Gram-Negative Bacteria

1. 氨基糖苷类抗生素（如新霉素和妥布霉素）与肽核酸（PNA）通过铜催化点击反应共价结合，形成具有双重作用机制的抗菌化合物。研究证实，这种共轭物能增强对耐药菌的活性，其机制涉及外膜通透性增强和胞内反义基因沉默，同时揭示了内膜电位变化对药物递送的影响，并发现SbmA转运蛋白在共轭物跨膜运输中起关键作用。

　　本文探讨了一种新的抗菌策略，即通过将氨基糖苷类抗生素（AGs）与肽核酸（PNA）寡核苷酸偶联，以克服细菌对传统AGs的耐药性。氨基糖苷类抗生素自20世纪40年代发现以来，因其广泛的抗菌谱而被广泛应用。然而，随着抗菌药物的长期使用，细菌逐渐发展出多种耐药机制，包括通过增加AGs的外排、修饰其靶点rRNA或通过酶促失活等。这些耐药机制导致AGs在临床上的效果减弱。为了解决这一问题，研究者尝试将AGs与PNA偶联，利用其双重作用机制（即与细菌膜的相互作用和抗病毒的反义作用）提高抗菌活性。

PNA是一种合成的核酸模拟物，其结构不同于DNA或RNA，其磷酸骨架被N-取代的2-氨基乙基甘氨酸单元取代，通过酰胺键连接。这种独特的结构使PNA具有较高的稳定性，并且不易被细菌的酶降解。此外，由于PNA的中性骨架，它能够与天然核酸结合，而不会受到静电排斥的影响。然而，PNA本身无法穿透细菌的细胞膜，除非与某种载体偶联。因此，研究者设想，将AGs作为PNA的载体，利用其阳电荷与细菌膜的负电荷相互作用，从而促进PNA进入细菌细胞，实现其反义活性。

为了实现这一目标，研究者采用了铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），将5′-叠氮修饰的NEO或6′-叠氮修饰的AMK与含有炔基连接子的PNA偶联。通过这种方法，研究团队合成了四种新的AG-PNA偶联物：NEO-PNA、AMK-PNA以及它们的错配序列类似物。这些偶联物的抗菌活性在多种细菌株中进行了测试，包括对AGs耐药的菌株。实验结果表明，NEO-PNA在某些情况下表现出比原始AGs更高的抗菌活性，尤其是在对抗NEO耐药的沙门氏菌株时。

为了进一步验证AG-PNA偶联物的作用机制，研究者进行了多个实验。其中包括使用错配序列的PNA与AGs的偶联物，以确认反义机制对抗菌活性的贡献。此外，还使用了红色荧光蛋白（RFP）的mRNA作为靶标，评估PNA是否能够进入细菌细胞并干扰其翻译过程。实验结果显示，NEO-PNA能够有效抑制RFP的表达，而AMK-PNA则未能达到这一效果，表明NEO在促进PNA进入细菌细胞方面更具优势。

为了探讨AG-PNA偶联物是否能够通过细菌的细胞膜，研究者进行了膜渗透实验。其中，使用NPN（N-苯基-1-萘胺）作为外膜渗透的指示剂，发现AG-PNA偶联物在一定程度上能够破坏细菌的外膜，这与AGs的膜破坏机制类似。然而，对于内膜的渗透性测试显示，AG-PNA偶联物并不显著破坏内膜的完整性，这表明内膜可能成为AG-PNA进入细胞的主要障碍。

进一步的实验还评估了SbmA转运蛋白在AG-PNA进入细菌细胞中的作用。SbmA是一种非特异性转运蛋白，负责将亲水性分子如AGs转运到细菌细胞内。实验结果显示，NEO-PNA和AMK-PNA的抗菌活性依赖于SbmA转运蛋白的存在，表明它们的进入需要该蛋白的协助。这一发现为未来的抗菌药物设计提供了新的思路，即通过调控转运蛋白的活性来增强药物的细胞内作用。

此外，研究还探讨了AGs与PNA偶联后的膜相互作用变化。通过测量膜电位的变化，研究者发现AG-PNA偶联物在一定程度上能够改变细菌内膜的电势，从而影响其渗透性。然而，这种改变并不足以促进其进入细胞，说明内膜的结构和电势可能对AG-PNA的进入构成显著障碍。

总的来说，这项研究为解决AGs耐药性问题提供了一种新的策略。通过将AGs与PNA偶联，不仅保留了AGs与细菌膜的相互作用能力，还赋予了PNA进入细胞的能力，从而实现了双重抗菌机制。然而，由于内膜的结构和电势对AG-PNA偶联物的进入构成障碍，进一步的研究需要探索如何优化偶联物的结构，以提高其在细胞内的作用效率。此外，还需要考虑AGs的电荷和结构对偶联物性能的影响，以及如何通过调整这些因素来增强抗菌效果。这些发现为未来设计新型抗菌药物提供了理论基础和技术方向，同时也揭示了细菌耐药机制的复杂性，强调了开发新型抗菌策略的重要性。