为基因编码的具有高动态范围的Zn2+传感器重新设计钙调蛋白

《Chemical & Biomedical Imaging》：Redesign of Calmodulin for Genetically Encoded Zn2+ Sensing with High Dynamic Range

钙调蛋白理性改造与定向进化策略成功开发出高动态范围锌离子传感器mNG-ZnM1.0，其在体外和活细胞/斑马鱼模型中均展现出优异的锌离子响应特性与选择性，为金属离子探针设计提供新范式。

　　在现代生物医学研究中，金属离子的动态监测是理解其在细胞功能中所扮演角色的关键。锌离子（Zn2?）作为细胞内重要的微量元素，其浓度和分布的变化与多种生理和病理过程密切相关。然而，传统方法在对活体生物进行Zn2?监测时存在一定的局限性。因此，科学家们致力于开发更加高效、灵敏和适用范围更广的生物传感器，以实现对Zn2?的精确检测。

为了克服这一挑战，研究人员对钙结合蛋白钙调神经素（CaM）进行了理性设计和优化。CaM在钙离子感应领域已被广泛研究，其EF-hand结构域能够高效地将钙离子结合引发的构象变化转化为可检测的荧光信号。相比之下，天然的锌结合结构域在信号传递效率方面存在不足，限制了锌离子探针的性能。因此，本研究的目标是通过改造CaM的结构，使其具备对Zn2?的高选择性和灵敏度，同时保留其较高的动态范围，从而开发出一种新型的锌离子生物传感器。

研究首先对CaM的四个EF-hand结构域中的钙结合位点进行了改造，将关键的钙结合残基替换为富含组氨酸（His）或半胱氨酸（Cys）的残基，以模拟锌离子的配位特性。其中，20H变体（mNG-ZnM）在响应Zn2?方面表现出较高的选择性，但其动态范围相较于钙离子探针有所下降。为了解决这一问题，研究团队进一步通过饱和突变和定向进化的方法对mNG-ZnM进行了优化，最终得到了性能显著提升的mNG-ZnM1.0变体。该变体不仅在体外实验中展现出高达20倍的动态范围，而且在活细胞中也达到了4倍的动态范围，这使其在灵敏度和适用性方面优于现有的锌离子探针。

在实验设计方面，研究团队采用了一种系统化的策略。首先，通过多步重叠PCR技术引入所需的突变，随后在大肠杆菌中进行表达和纯化。为了提高筛选效率，研究人员还构建了一个基于Luria–Bertani（LB）琼脂板的定向进化体系，结合红/绿菌落选择系统，有效排除了非特异性突变带来的干扰。最终，通过荧光光谱分析和动态范围测试，确认了mNG-ZnM1.0在锌离子检测方面的优异性能。

此外，为了验证该探针在活细胞和亚细胞器中的适用性，研究团队还对探针进行了亚细胞定位改造。例如，通过在探针的N端添加信号肽并在C端添加内质网（ER）滞留序列，使其能够特异性地定位到ER中，从而实现对ER内锌离子动态变化的监测。实验结果表明，mNG-ZnM1.0在活细胞中能够准确地检测锌离子浓度的变化，并在体内实验中成功实现了对斑马鱼胚胎发育过程中锌离子分布的实时可视化。

在功能特性方面，mNG-ZnM1.0表现出良好的光稳定性，能够在长时间的荧光成像过程中保持信号的稳定性和可重复性。其动态范围和灵敏度的提升，使得该探针能够捕捉到细胞内锌离子浓度的微小波动，这对于研究锌离子在细胞信号传导、代谢调控等过程中的作用具有重要意义。同时，该探针在不同组织和细胞类型中的广泛应用性，也表明其在多种生物医学研究中的潜在价值。

通过这一研究，科学家们不仅开发出了一种高效的锌离子探针，还探索了如何通过结构引导的蛋白质工程和定向进化技术来重新编程经典的蛋白质支架，使其具备新的功能。这一方法为未来开发针对其他金属离子或信号分子的生物传感器提供了重要的理论基础和技术路径。此外，该研究还揭示了锌离子与钙离子在配位机制上的差异，以及关键残基（如Asp1）在信号传递中的重要作用，为理解金属离子传感的分子机制提供了新的视角。

总之，本研究通过系统化的结构改造和优化策略，成功开发出了一种具有高动态范围和高灵敏度的锌离子生物传感器。该探针不仅在体外和活细胞中表现出优异的性能，还在斑马鱼体内成功实现了对锌离子动态变化的实时监测。这一成果为深入研究锌离子在生物体内的生理和病理作用提供了强有力的工具，同时也为未来开发更多功能性的生物传感器奠定了基础。