三氧化二砷预处理可减轻小鼠的肝缺血-再灌注损伤：ERK/AKT信号通路和自噬的作用

《Chinese Medical Journal》：Arsenic trioxide preconditioning attenuates hepatic ischemia- reperfusion injury in mice: Role of ERK/AKT and autophagy

低剂量砷三氧化物（ATO）通过激活ERK/PI3K-AKT通路诱导自噬，减轻肝缺血再灌注损伤（HIRI）并促进肝细胞再生。研究建立70%肝缺血及30%肝叶切除动物模型和原代肝细胞缺氧再氧合模型，发现ATO预处理显著降低ALT/AST水平，减少肝细胞凋亡和炎症反应，并通过ERK依赖性自噬增强肝细胞增殖能力。机制上，ATO激活ERK和PI3K-AKT通路，促进LC3-II型和Beclin-1表达，增加自噬体数量，抑制caspase-3活性。抑制ERK通路可逆转ATO的肝保护作用，而PI3K-AKT抑制剂影响较小。该研究为ATO在肝损伤治疗中的应用提供了理论依据。

　　### 研究背景

肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury, HIRI）是临床上一种常见的病理现象，常出现在出血性休克、严重创伤、肝脏部分切除手术以及肝脏移植等情况下。HIRI不仅影响肝脏功能，还可能导致严重的肝功能衰竭，是手术和器官移植过程中需要重点关注的问题之一。尽管已有大量研究揭示了HIRI的复杂病理机制，包括活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的产生、内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）、钙离子超载、无菌性炎症反应和自噬等，但目前尚缺乏有效的预防或治疗策略。

近年来，三氧化二砷（Arsenic Trioxide, ATO）作为一种传统中药成分，因其在癌症治疗中的应用而受到广泛关注。早在20世纪70年代，哈尔滨医科大学的研究人员就发现ATO在治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia, APL）方面具有显著疗效。如今，ATO已被列为年轻、非高危APL患者的一线治疗药物之一。此外，ATO在多种实体瘤治疗中也表现出抑制细胞周期、诱导细胞凋亡、减少血管生成和抑制肿瘤侵袭与转移的能力。然而，ATO对HIRI的作用尚未被系统研究，其在肝脏保护中的具体机制也尚未完全明确。

自噬是一种细胞自我更新和清除受损细胞成分的生理过程，通常在细胞受到应激时被激活，以维持细胞内环境的稳定。肝脏中富含溶酶体，因此自噬在多种肝脏疾病中扮演着重要角色，如肝细胞癌、缺血再灌注损伤以及非酒精性脂肪性肝炎。一些研究发现，自噬的激活有助于减轻肝脏损伤。例如，Moti?o等发现，环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）通过激活自噬减轻了肝脏缺血再灌注过程中的损伤。Xue等也指出，垂体腺苷环化酶激活多肽（Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide, PACAP）能够促进肝细胞的自噬过程，从而对抗HIRI。此外，一些研究还表明ATO能够诱导自噬，这为探索其在肝脏保护中的作用提供了新的视角。

基于上述背景，本研究旨在进一步阐明ATO在HIRI中的作用机制，特别是其对自噬和ERK/PI3K-AKT信号传导通路的影响，从而为ATO在肝脏保护领域的应用提供理论支持。

### 研究方法

本研究采用了动物和细胞模型相结合的方式，系统地评估了ATO对HIRI的保护作用。首先，研究人员建立了70%肝脏温缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤和部分肝切除（Partial Hepatectomy, PHx）的动物模型。在动物实验中，研究人员将小鼠随机分为四个组：假手术组（Sham + 正常生理盐水）、I/R损伤组（I/R + 正常生理盐水）、ATO预处理组（Sham + ATO）以及I/R损伤+ATO预处理组（I/R + ATO）。每组小鼠数量为7只，实验过程中遵循标准的动物伦理规范。

在细胞实验中，研究人员使用了原代肝细胞，通过模拟缺氧/再灌注（Anoxia/Reoxygenation, A/R）的条件，建立了体外模型。为评估ATO对肝细胞的影响，研究人员采用了多种实验方法，包括细胞活力检测（CCK-8试剂盒）、细胞凋亡检测（TUNEL实验、caspase-3活性检测、DNA碎片分析）、自噬活性检测（GFP-mRFP-LC3荧光标记、透射电镜观察）、以及肝脏功能评估（血清ALT和AST水平检测、组织病理学分析、免疫组织化学染色、Western blot和qRT-PCR检测等）。此外，为了探讨ERK和PI3K-AKT信号通路在ATO保护作用中的作用，研究人员使用了特异性抑制剂U0126（MEK1/2抑制剂）和LY294002（PI3K抑制剂），并在体外和体内实验中测试了这些抑制剂对ATO诱导的信号通路激活的影响。

在实验过程中，研究人员首先确定了ATO的最适剂量，确保其在体外和体内的应用不会引起肝毒性。随后，通过一系列实验验证了ATO对肝细胞的保护作用，并进一步探讨其对自噬和信号通路的影响。所有实验数据均采用Student’s t-test进行统计分析，显著性水平设定为P < 0.05。

### 研究结果

研究结果表明，低剂量的ATO（体外为0.75 μmol/L，体内为1 mg/kg）在不引起肝毒性的情况下，显著减轻了肝脏I/R损伤。在体外实验中，ATO处理的肝细胞表现出更高的细胞活力和更低的乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放水平，表明细胞损伤减少。在体内实验中，与对照组相比，ATO预处理的小鼠在I/R后6小时，血清ALT和AST水平显著降低，同时肝脏组织的病理学变化也有所改善，包括组织坏死、炎症细胞浸润和出血性改变的减少。

进一步的实验显示，ATO能够显著抑制I/R诱导的炎症反应。通过ELISA检测，研究人员发现与对照组相比，ATO处理的小鼠血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）的水平明显下降。此外，qRT-PCR分析也表明，ATO能够显著降低这些炎症相关基因的表达水平。这些结果表明，ATO不仅能够减轻肝脏损伤，还能够抑制炎症反应，从而改善肝脏功能。

在细胞凋亡方面，研究发现ATO能够显著减少肝细胞的凋亡。TUNEL实验显示，与对照组相比，ATO处理的肝细胞中凋亡阳性细胞的比例显著降低。caspase-3活性检测和DNA碎片分析进一步支持了这一结论，表明ATO能够有效抑制凋亡相关蛋白的活性。同时，Western blot和qRT-PCR分析显示，ATO能够调节BCL2和BAX等凋亡相关蛋白的表达水平，从而降低肝细胞凋亡的风险。

此外，研究还发现ATO能够促进肝细胞的再生。通过免疫组织化学染色（BrdU标记）和Western blot分析（PCNA、cyclin D1和cyclin E1蛋白的表达），研究人员发现ATO预处理的小鼠在部分肝切除后表现出更高的肝细胞增殖能力。肝重/体重比（Liver Weight/Body Weight, LW/BW）分析进一步表明，ATO能够显著改善肝脏再生过程，提高小鼠的存活率。这些结果表明，ATO不仅能够减轻肝细胞损伤，还能够促进肝细胞的再生，从而加速肝脏的恢复。

在自噬方面，研究发现ATO能够显著激活自噬过程。通过GFP-mRFP-LC3荧光标记和透射电镜观察，研究人员发现ATO处理的肝细胞中自噬体的数量和自噬流的效率显著提高。Western blot分析也显示，ATO能够显著上调LC3 II和Beclin 1的表达，同时降低P62蛋白的水平，这表明自噬被激活。此外，研究还发现，ERK信号通路在ATO诱导的自噬过程中起着主导作用。通过使用ERK抑制剂U0126和PI3K-AKT抑制剂LY294002，研究人员发现只有U0126能够显著逆转ATO诱导的自噬激活，而LY294002对自噬无明显影响。这表明，ATO的自噬激活主要依赖于ERK信号通路。

### 讨论

ATO在癌症治疗中的广泛应用使其成为一种重要的抗癌药物。然而，由于其潜在的细胞毒性，ATO在其他疾病治疗中的应用受到了一定限制。近年来，一些研究开始关注ATO在非恶性疾病中的治疗潜力，例如动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）和实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE）。这些研究发现，ATO能够通过激活自噬来减轻疾病症状，这为探索其在肝脏保护中的作用提供了新的思路。

在本研究中，研究人员发现ATO能够通过激活ERK和PI3K-AKT信号通路来减轻肝脏I/R损伤。ERK和PI3K-AKT信号通路在细胞存活和增殖中起着关键作用，尤其是在缺血和再灌注条件下。研究表明，ERK的激活能够保护心肌细胞免受凋亡，并促进血管生成，从而减轻心脏损伤。PI3K-AKT信号通路同样在多种组织损伤中发挥保护作用，包括急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI）。这些发现表明，ERK和PI3K-AKT信号通路在肝脏保护中具有重要意义。

此外，研究还发现，ATO的保护作用主要依赖于自噬的激活。自噬作为一种细胞内清除机制，能够帮助细胞在缺血再灌注过程中维持稳态，减少细胞损伤。在本研究中，ATO的自噬激活作用得到了多种实验方法的验证，包括荧光标记和透射电镜观察。然而，研究还发现，自噬的激活主要依赖于ERK信号通路，而非PI3K-AKT通路。这与之前的研究结果有所不同，表明在特定条件下，ERK可能在自噬调控中发挥更关键的作用。

综上所述，本研究发现ATO能够通过激活ERK和PI3K-AKT信号通路，促进自噬，从而减轻肝脏I/R损伤并促进肝细胞再生。这一发现为ATO在肝脏保护领域的应用提供了新的理论依据，并为未来的研究和临床应用提供了方向。然而，进一步的研究仍需探讨ATO在不同病理条件下的具体作用机制，以及其在不同剂量和时间点下的效果差异。此外，还需要评估ATO在人体中的安全性和有效性，以期将其应用于临床治疗。