滑液微小RNA生物标志物能够准确诊断髋关节和膝关节假体周围感染

《JBJS》：Synovial Fluid MicroRNA Biomarkers Enable Accurate Diagnosis of Hip and Knee Periprosthetic Joint Infections

本研究通过小RNA测序和RT-qPCR分析，发现髋膝置换术后感染患者滑液中miR-223-3p、miR-338-5p上调，而miR-151a-3p、miR-214-3p下调，构建的多变量模型AUC达0.96，为感染诊断提供新生物标志物。

　　### 临床背景与研究意义

在髋关节和膝关节置换手术后，如何准确诊断周围关节感染（PJI）一直是医学界面临的重要挑战。PJI是指人工关节周围出现的感染，它不仅会影响患者的康复过程，还可能导致严重的并发症，如关节功能丧失、假体松动和需要二次手术。传统的诊断方法通常依赖于临床症状、实验室检查以及微生物学结果，但这些方法在某些情况下可能不够敏感或特异性，特别是在感染类型不明或微生物培养结果阴性的情况下。因此，寻找一种更为准确、非侵入性的诊断手段显得尤为迫切。

近年来，细胞外微小RNA（miRNA）作为一种新兴的生物标志物，在多种疾病的诊断和预后评估中展现出巨大的潜力。miRNA是一类长度约为20-25个核苷酸的非编码小RNA分子，它们在细胞内发挥调控基因表达的作用，参与多种生理和病理过程。由于miRNA具有高度的稳定性和可检测性，它们在体液中的表达变化可以作为感染的生物标志物。研究者发现，某些miRNA在感染性关节液中会显著变化，这提示了miRNA可能在PJI的诊断中扮演重要角色。

### 研究方法与技术路线

本研究采用了一种系统性的方法来探索髋关节和膝关节PJI的miRNA生物标志物。首先，研究团队收集了173例接受髋关节或膝关节置换术的患者，其中包括66例被归类为PJI的患者和107例非感染性患者。此外，还纳入了6例骨关节炎患者的膝关节滑液样本作为对照组。所有样本均按照2018年国际共识会议制定的PJI感染标准进行分类，并在盲法下进行分析，以确保结果的客观性。

为了筛选潜在的miRNA生物标志物，研究团队首先对40份样本（其中20份为感染性样本，20份为非感染性样本）进行了小RNA高通量测序（NGS）。这一过程允许研究人员进行无目标的、全基因组范围内的miRNA分析，从而发现那些在感染性与非感染性样本之间存在显著差异的miRNA。接下来，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对这些候选miRNA进行了技术验证，以确保NGS结果的可靠性和可重复性。RT-qPCR是一种高灵敏度和特异性的技术，能够用于进一步的独立样本验证。

为了提高诊断的准确性，研究团队还利用机器学习方法构建了多变量miRNA模型。通过将发现组和验证组合并为一个完整的队列（共173份样本），研究人员能够利用交叉验证等技术优化模型参数，并评估不同miRNA组合对诊断性能的影响。最终，研究团队确定了一种由miR-338-5p和miR-214-3p组成的双变量模型，该模型在测试数据集中表现出较高的诊断准确性，其曲线下面积（AUC）达到了0.969，显示出在区分感染性与非感染性样本方面的强大能力。

### 研究结果与发现

通过NGS分析，研究团队在感染性与非感染性滑液样本之间发现了132种具有显著差异的miRNA（FDR < 0.05）。其中，62种miRNA的表达水平在感染性样本中上调，而70种miRNA则下调。值得注意的是，miR-223-3p和miR-338-5p在感染性样本中表现出最显著的上调，其对数2倍变化（log2FC）超过了4，表明这些miRNA在感染过程中可能具有重要的生物学意义。相反，miR-151a-3p和miR-214-3p则在感染性样本中显著下调，其中miR-214-3p的表达水平减少了四倍。

为了进一步验证这些miRNA的诊断价值，研究团队对133份独立样本进行了RT-qPCR分析，其中46份被归类为感染性样本。结果表明，所有候选miRNA都能在独立样本中得到成功验证，其效应大小和显著性水平与发现组的结果高度一致。此外，通过多变量分析，研究人员发现结合多个miRNA可以显著提高诊断性能。在测试数据集中，单变量模型的AUC仅为0.83，而四变量模型的AUC则提升至0.96，显示出多变量模型在提高诊断准确性方面的优势。

研究团队还分析了这些miRNA在不同子群体中的表现，包括不同性别、不同关节类型（髋关节和膝关节）以及不同感染阶段（早期急性、晚期急性和慢性感染）。结果显示，该模型在所有子群体中均表现出稳定的诊断性能，其AUC值均超过了0.94。此外，该模型在培养阴性（culture-negative）和培养阳性（culture-positive）的PJI样本中也表现良好，其中在早期急性感染样本中，AUC值甚至达到了0.987，这表明miRNA生物标志物在诊断不同类型的PJI方面具有广泛的适用性。

### 生物学机制与临床应用潜力

为了进一步理解这些miRNA在PJI中的生物学意义，研究团队利用公开的FANTOM5数据集，分析了这些miRNA的细胞来源。结果显示，miR-338-5p和miR-223-3p主要来源于中性粒细胞，这些细胞在感染过程中会大量浸润到关节腔内并释放miRNA。而miR-142-3p和miR-142-5p则主要来源于适应性免疫细胞，如B细胞、T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞），它们在感染期间的激活会导致这些miRNA的释放。另一方面，miR-214-3p主要来源于间质细胞，如软骨细胞，其表达水平在感染期间被显著抑制，这可能与其在慢性炎症中的作用有关。

这些发现表明，PJI引起的miRNA变化主要来源于免疫细胞的浸润和激活，以及关节组织细胞对炎症信号的响应。miRNA的这种变化不仅反映了感染的存在，还可能提示感染的类型和严重程度。因此，miRNA可以作为独立于病原体的生物标志物，为PJI的诊断提供新的视角。

此外，研究团队还发现，miRNA的诊断性能不受样本收集方法的影响。无论是通过离心法还是直接采集的滑液样本，miRNA生物标志物的检测结果均表现出高度的一致性。这为临床应用提供了便利，因为无论样本是如何获取的，都可以使用miRNA作为诊断工具。

### 临床意义与未来研究方向

本研究的结果对临床实践具有重要的意义。首先，miRNA作为一种非侵入性的生物标志物，可以为PJI的诊断提供新的方法。与传统的实验室检测方法相比，miRNA检测具有更高的灵敏度和特异性，尤其是在培养阴性感染的诊断中，其表现尤为突出。目前，临床上常用的滑液检测方法，如白细胞计数和中性粒细胞百分比，往往难以提供明确的诊断信息，而miRNA检测则可能弥补这一不足。

其次，miRNA生物标志物的诊断性能不受感染病原体类型的影响，这意味着它们可以用于诊断多种病原体引起的PJI。这一点尤为重要，因为许多PJI病例在微生物培养中未能检测到病原体，导致诊断困难。因此，miRNA可以作为一种辅助诊断工具，帮助医生在微生物培养结果不确定时做出更准确的判断。

最后，研究团队还指出，尽管本研究取得了显著成果，但其结论的推广性仍需进一步验证。目前的研究仅在单一中心进行，未来需要在不同中心和不同患者群体中进行多中心研究，以确保miRNA生物标志物的诊断性能具有普遍适用性。此外，还需要进一步探讨这些miRNA在其他术后并发症中的诊断价值，例如金属毒性（metallosis）等，以避免可能的交叉反应或误诊。

### 总结与展望

本研究通过NGS和RT-qPCR技术，发现了一组在髋关节和膝关节PJI中显著变化的miRNA生物标志物，并验证了它们在诊断中的有效性。这些miRNA不仅具有高度的灵敏度和特异性，而且能够独立于病原体类型，为PJI的诊断提供了新的思路。特别是miR-338-5p和miR-214-3p组成的双变量模型，在多个子群体中均表现出稳定的诊断性能，显示出在临床应用中的巨大潜力。

未来的研究可以进一步优化miRNA检测方法，使其更加便捷和经济，以便在临床实践中广泛应用。同时，随着更多关于miRNA在感染中的作用机制的研究，这些生物标志物可能会被用于更精细的感染分类和预后评估。此外，结合miRNA检测与敏感的微生物DNA检测技术，如下一代测序（NGS）或聚合酶链反应（PCR），可以进一步提高PJI诊断的准确性和可靠性。

总之，miRNA作为一种新兴的生物标志物，在PJI的诊断中展现出广阔的应用前景。它们的稳定性和可检测性，以及对多种感染类型的适应性，使其成为传统诊断方法的重要补充。随着技术的不断进步和研究的深入，miRNA检测有望成为PJI诊断中的标准工具，为患者提供更早、更准确的诊断，从而改善治疗效果和预后。