基于动力学模型的枯草芽孢杆菌 surfactin 高产工艺设计与优化

《AMB Express》：Model-based process design for surfactin production with Bacillus subtilis

本研究针对枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 高密度发酵生产 surfactin 过程中动力学认知不足及缺乏关键性能指标动态变化数据的问题，开展了基于模型的工艺设计研究。研究人员构建了一个包含生物量、底物、surfactin 和副产物乙酸的动力学模型，并成功应用于指导新型无批次补料发酵工艺，最终实现了 46.33 g/L 的 surfactin 产量和 2.11 g/(L·h) 的时空产率，显著提升了过程效率与理解。

　　

在工业生物技术领域，枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 堪称一位“明星”微生物，它能够生产多种有价值的次级代谢产物，其中就包括一种名为表面活性素 (surfactin) 的强大生物表面活性剂。这种由脂肪酸链和七个氨基酸组成的环状肽构成的分子，不仅能够显著降低液体表面张力，还具有抗菌、抗病毒等生物活性，在环境修复、微生物采油乃至医药领域展现出巨大的应用潜力。然而，尽管前景广阔，如何高效、经济地大规模生产 surfactin 却是一个长期存在的挑战。传统的批次发酵方式往往效率不高，而更先进的补料分批 (fed-batch) 策略，特别是能够实现高细胞密度培养的指数补料策略，被认为是提高产量的关键。但问题在于，我们对这些补料分批过程中微生物“内部世界”的动态变化——即细胞如何生长、如何消耗养分、如何合成目标产物以及如何产生副产物——的了解仍然非常有限。缺乏对这些动力学过程的深入理解，就像是在黑箱中操作，难以对工艺进行精准的预测和优化，从而限制了 surfactin 生产水平的进一步提升。

为了照亮这个“黑箱”，由 Eric Hiller 领导的研究团队在《AMB Express》上发表了一项研究，他们致力于为枯草芽孢杆菌 BMV9 菌株生产 surfactin 的补料分批过程构建一个可靠的动力学模型，并利用该模型来设计全新的高效生产工艺。这项研究的核心在于创建一个数学模型，该模型能够描述发酵过程中关键变量随时间的变化规律，从而将复杂的生物学过程转化为可预测、可计算的数学关系。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几个关键技术方法：首先，他们利用前期在30升生物反应器中进行的12组不同指数补料生长速率（0.075至0.4 h^-1）下的枯草芽孢杆菌BMV9高密度发酵实验数据作为模型参数化的基础，这些数据涵盖了细胞干重 (CDW)、葡萄糖、surfactin 和乙酸的动态变化。其次，他们基于莫诺德动力学 (Monod kinetics) 等原理，建立了一个包含生物量 (X)、底物葡萄糖 (S)、产物 surfactin (P) 和代表性溢出代谢副产物乙酸 (A) 这四个状态变量的常微分方程组模型，并考虑了乙酸对生长的抑制效应。模型求解和参数拟合在 MATLAB 环境中完成，并使用均方根误差 (RMSE) 进行统计评估。最后，他们利用验证后的模型进行过程设计，预测最优初始补料速率，并实际进行模型指导下的无批次补料发酵实验以验证预测效果。

模型参数化

研究的第一步是建立动力学模型。该模型包含了细胞生长（基于莫诺德动力学并扩展了乙酸抑制项）、底物消耗（用于生长、产物合成和副产物形成）、surfactin 形成（与生长关联）以及乙酸形成（作为溢出代谢的代表，其速率与葡萄糖浓度相关）的微分方程。研究人员使用来自12个不同补料生长速率实验的数据对模型参数进行拟合。结果显示，该模型能够较好地描述大多数实验条件下生物量积累、底物消耗和产物形成的动力学过程。特别值得注意的是，当尝试简化模型，忽略乙酸相关的效应时，模型拟合出现了生物学上不合理的结果，这凸显了在模型中考虑溢出代谢及其抑制效应的重要性。

指数补料速率实验

通过对不同指数补料生长速率下实验数据的模拟，模型成功捕捉了过程的关键特征。在补料生长速率不超过 0.25 h^-1 时，模型能准确模拟生物量的指数生长、surfactin 的伴随性生产以及乙酸的快速降解。对于更高的补料速率（0.3 和 0.4 h^-1），模型虽然能预测葡萄糖和乙酸的积累趋势，但在定量上存在一定偏差，尤其是在葡萄糖积累的预测上出现了高估，这表明模型在描述高强度溢出代谢方面尚有改进空间。模型还使得计算特定生长率、生产率等关键性能指标随时间的连续变化成为可能，极大地增强了对过程的理解。

模型验证与敏感性分析

为了评估模型的可靠性，研究人员进行了碳质量平衡验证，结果显示约58.3%的输入碳能够被模型中的主要含碳组分（生物量、surfactin、乙酸）所解释，未回收部分可能源于呼吸作用产生的CO₂等其他未建模产物。此外，通过莫里斯 (Morris) 方法进行的全局敏感性分析表明，模型对最大比生长速率 (μ_max^S)、最大乙酸形成速率 (b_max) 和底物维持系数 (m_S) 等参数最为敏感，这为后续模型修正和实验设计提供了重点方向。

模型指导的过程设计

在模型成功参数化的基础上，研究人员提出了一个创新的工艺设计：完全省略传统的批次阶段，直接从补料开始培养。利用模型对不同初始补料速率下最终 surfactin 浓度和时空产率 (P_V) 进行预测，发现存在一个最优区间。基于预测，他们选择了一个初始补料速率（28 g/h）和补料生长速率（0.2 h^-1）进行实验验证。实验结果与模型预测高度吻合：过程持续约22小时，最终获得了46.33 g/L的surfactin产量和2.11 g/(L·h)的时空产率，与模型预测值（49.16 g/L, 2.21 g/(L·h)）偏差很小。生物量和葡萄糖的动态变化也被模型较好地捕捉。这一模型指导的新工艺与传统含批次阶段的工艺相比，显著提高了产物浓度和生产效率，同时避免了葡萄糖和乙酸的过度积累，证明了模型用于工艺创新的强大能力。

模型的局限性

尽管模型在多数情况下表现良好，但研究也揭示了其局限性。当尝试超越模型验证的范围，例如将补料体积从10升增加至15升时，模型未能预测到实验中观察到的葡萄糖显著积累、surfactin 降解以及乙酸动态的异常变化。此外，当使用不同预培养条件导致初始乙酸浓度较高时，模型对乙酸动态的预测也出现较大偏差。这些情况表明，当前模型对于底物严重过剩或初始条件剧烈变化下，更复杂的溢出代谢网络（可能涉及乙酰丁醇、乳酸等其他代谢物）的描述能力不足。

综上所述，这项研究成功地开发并验证了一个用于描述枯草芽孢杆菌生产 surfactin 的补料分批过程的动力学模型。该模型不仅显著增强了对过程动力学的理解，使得关键性能指标的可视化和计算成为可能，更重要的是，它被直接应用于设计并实验验证了一种高效的无批次发酵新策略，极大地提升了surfactin的生产水平。尽管模型在应对极端代谢条件时存在局限，但这恰恰指明了未来改进的方向，即需要更深入地研究枯草芽孢杆菌的溢出代谢网络。这项研究工作为基于模型的过程优化和理解提供了强有力的工具和范例，对于推动包括生物表面活性剂在内的微生物发酵产业走向更高效、更可控的未来具有重要的意义。