非编码SNP rs1544105通过调控FPGS表达增强甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病疗效的多维验证研究

《Molecular Biomedicine》：A single non-coding SNP in FPGS modulates folate drug efficacy in acute lymphoblastic leukemia: data-driven exploration and experimental validation

本研究针对急性淋巴细胞白血病(ALL)维持治疗中甲氨蝶呤(MTX)疗效个体差异的临床难题，通过整合生物信息学、系统荟萃分析、基因编辑(Prime Editing)及多组学实验技术，首次证实FPGS基因非编码区SNP rs154004105的GG基因型可通过增强转录因子CREB1结合力提升FPGS转录活性，进而促进MTX多聚谷氨酸化代谢，显著提高细胞内药物蓄积浓度和抗肿瘤效果。该发现为ALL患者MTX个体化用药提供了重要分子标志物和机制靶点。

　　

在儿童血液系统恶性肿瘤中，急性淋巴细胞白血病(ALL)占据重要地位。虽然化疗可使约80%的患儿获得初期缓解，但耐药导致的复发仍是临床面临的严峻挑战，全球ALL复发率高达15%-20%，且每次复发都会进一步恶化预后。70余年来，甲氨蝶呤(MTX)始终是ALL维持治疗的一线化疗药物，其通过抑制肿瘤细胞叶酸代谢，干扰DNA复制等关键细胞过程发挥抗肿瘤作用。然而，由于MTX是二价阴离子，其跨膜转运依赖特定膜转运蛋白和受体，且易被双向阴离子转运蛋白识别和外排，限制其细胞内滞留和治疗效果。因此，增强MTX细胞内蓄积对于最大化其治疗潜力至关重要。

叶酰聚γ-谷氨酸合成酶(FPGS)在延长MTX细胞内滞留中起关键作用。一旦MTX进入细胞，FPGS快速催化其γ-羧基添加多个谷氨酸残基，转化为聚阴离子，显著增强细胞内滞留的同时提高MTX对其靶酶亲和力。因此，FPGS相关基因座的遗传多态性或突变可能是确保MTX维持治疗疗效的关键因素。

尽管药物基因组学进展已识别众多化疗耐药相关基因和SNP位点，但遗传多态性研究与传统化疗的临床整合仍有限。许多遗传多态性或突变仅通过关联分析识别，缺乏功能验证，限制其在指导个体化用药方案中的临床应用。尤其对于非编码区变异，多数证据基于统计关联，功能机制不明。FPGS基因非编码区存在多个SNP位点，其中rs1544105位于启动子区，既往研究结论存在争议。部分研究报道该位点多态性可能影响MTX疗效和不良事件，而另一些研究未发现其与MTX治疗结局的关联。

针对这一科学问题，南京大学研究团队在《Molecular Biomedicine》发表最新研究，通过多维策略揭示FPGS基因非编码区SNP rs1544105调控MTX疗效的分子机制。研究首先对经历两次复发的ALL患者(ALL028)进行生物信息学分析，发现首次复发涉及FPGS基因局灶性缺失(~20%克隆性)，第二次复发显示FPGS SNP位点突变(>60%克隆性)，提示FPGS基因突变可能导致接受MTX维持治疗的ALL患者疾病复发。

通过系统荟萃分析11项研究，发现与GG基因型相比，rs1544105位点的AA基因型增加疾病进展风险(OR:2.23;95% CI:1.16-4.30;p=0.017)，并升高血浆MTX浓度-剂量比：24小时(WMD:2.27;95% CI:1.04-4.40;p=0.002)和40小时(WMC:0.02;95% CI:0.00-0.04;p=0.033)。等位基因模型中，A等位基因与1.43倍疾病进展风险相关(95% CI:1.01-2.02;p=0.045)。

利用prime editing技术，研究人员成功构建rs1544105 A>G纯合突变293T细胞(Mut-293T)。实验显示突变型细胞FPGS mRNA和蛋白表达上调约1.5倍(p<0.05)，细胞内MTX滞留增强(p<0.05)。机制上，双荧光素酶报告基因和电泳迁移率变动分析表明，rs1544105 A>G增强该序列与转录因子CREB1结合亲和力，从而提高FPGS转录活性。

细胞实验证实Mut-293T细胞在MTX处理下活力显著降低，细胞外MTX积累更高，凋亡比例增加。动物实验进一步验证，Mut-293T异种移植瘤模型经MTX治疗后肿瘤生长显著减慢，肿瘤重量仅为野生型的0.3倍(p<0.005)，组织学分析显示更大坏死区域、更高凋亡和降低的肿瘤细胞活力。

主要关键技术方法包括：对复发ALL患者样本进行生物信息学克隆进化分析；采用PRISMA指南进行系统荟萃分析；利用prime editing技术构建基因编辑细胞模型；通过双荧光素酶报告基因实验、电泳迁移率变动分析(EMSA)验证转录调控机制；采用细胞活力检测(CCK8)、高效液相色谱(HPLC)和流式细胞术评估药物敏感性；建立小鼠异种移植瘤模型进行体内药效验证。

FPGS基因缺失和SNP突变作为ALL复发的关键因素

通过对复发ALL患者的生物信息学分析，发现FPGS基因突变与MTX维持治疗期间的疾病复发相关。首次复发涉及FPGS局灶性缺失，第二次复发显示FPGS SNP位点突变，表明FPGS基因改变可能促进ALL复发。

FPGS SNP多态性与ALL进展和MTX治疗结局的关联

系统荟萃分析显示，rs1544105位点的A等位基因与ALL疾病进展风险增加显著相关，且AA基因型患者MTX浓度-剂量比显著高于GG基因型，提示该位点多态性影响MTX pharmacokinetics。

rs1544105作为FPGS基因的表达数量性状位点(eQTL)

通过三个在线eQTL数据库分析，证实rs1544105是FPGS的cis-eQTL(p=8.7×10^-16至1.1×10^-10)，表明该位点具有调控基因表达的潜在功能。

成功构建突变-293T细胞并验证FPGS表达上调

采用prime editing技术成功构建rs1544105 A>G纯合突变细胞系。RT-PCR、qPCR和Western blot证实Mut-293T细胞FPGS mRNA和蛋白表达显著上调，而邻近基因表达未受影响，证明rs1544105 GG基因型与更高FPGS表达相关。

Mut-293T细胞通过调控转录因子结合增强转录活性

生物信息学预测和实验验证表明，rs1544105 G基因型增强与转录因子CREB1结合亲和力，双荧光素酶报告基因实验显示rs1544105 G基因型转录活性显著高于A基因型，阐明其调控FPGS表达的分子机制。

Mut-293T细胞显著增强MTX体外疗效

药物压力实验显示FPGS表达不受MTX浓度影响。CCK8实验表明Mut-293T细胞对MTX敏感性显著提高，细胞外MTX浓度积累更多，凋亡比例更高，证实GG基因型增强MTX细胞毒性作用。

Mut-293T细胞在异种移植模型中显著增强MTX疗效

动物实验证实，Mut-293T移植瘤经MTX治疗后肿瘤生长显著抑制，肿瘤重量减轻，组织病理学显示坏死区域扩大、凋亡增加和细胞增殖抑制，验证rs1544105 GG基因型在体内增强MTX抗肿瘤效果。

研究结论与讨论部分强调，该研究通过整合生物信息学、系统荟萃分析、基因编辑和实验验证，首次从功能角度证实FPGS非编码区SNP rs1544105通过调控CREB1介导的转录活性影响FPGS表达，进而调节MTX多聚谷氨酸化代谢和细胞内蓄积，最终影响药物疗效。值得注意的是，rs1544105 G>A是高频变异(等位基因频率0.483)，这一发现对ALL精准医疗具有重要转化价值。对于携带AA基因型的患者，不建议将MTX作为维持治疗药物，而亲脂性抗叶酸药物如三甲曲沙可能成为潜在替代方案。研究方法学上，采用prime editing技术直接编辑非编码区SNP，为后续药物基因组研究非编码单核苷酸变异提供可靠实验平台。尽管存在样本量限制和细胞模型局限性，但多维证据链为FPGS rs1544105位点的临床意义提供坚实理论基础，为推进ALL精准医疗和克服复发挑战提供重要见解。